1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：四環(huán)素可控表達(dá)Cyclin B1的載體構(gòu)建和單克隆細(xì)胞株的篩選
　　 目的：篩選四環(huán)素誘導(dǎo)細(xì)胞周期素B1(Cyclin B1)可控表達(dá)的293單克隆細(xì)胞株(Tetracycline-Regulated Expression 293 cells，T-Rex?-293)。
　　 方法：用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reactions，PCR)的方法從人胎肝cDN

2、A 文庫中調(diào)出帶有酶切位點(diǎn)的Cyclin B1基因全長，在37 ℃經(jīng)過BamH1和X-bal1雙酶切過夜后，與經(jīng)過同樣酶切后的pcDNA4/TO/myc-HisB 載體在16 度連接過夜，轉(zhuǎn)化BL21細(xì)菌感受態(tài)，然后涂在帶有氨芐抗性的LB 培養(yǎng)板上，37 度培養(yǎng)過夜，挑細(xì)菌克隆，搖菌，測(cè)序鑒定。接著大提測(cè)序正確的質(zhì)粒，用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染T-Rex?-293細(xì)胞，用含有殺稻瘟菌素(Blasticidin，5μ

3、g/ml)和腐草霉素(Zeocin，200μg/ml)雙藥物的DMEM 培養(yǎng)兩周后，將細(xì)胞傳96孔板，等單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增出單細(xì)胞克隆。最后，用Western blot和流式細(xì)胞儀檢測(cè)單克隆細(xì)胞株在加入四環(huán)素誘導(dǎo)后目的基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：構(gòu)建的pcDNA4/TO/myc-HisB-Cyclin B1 載體，經(jīng)英駿公司測(cè)序鑒定序列正確。篩選出的單克隆細(xì)胞株，在未加四環(huán)素時(shí)沒有外源性的Cyclin B1表達(dá)，在加入四環(huán)素后，3

4、小時(shí)就有表達(dá)，隨時(shí)間的增加，Cyclin B1表達(dá)量也增加，48 小時(shí)最多。
　　 結(jié)論：篩選出的T-Rex?-293單克隆細(xì)胞株能經(jīng)四環(huán)素可控表達(dá)Cyclin B1。
　　 第二部分：G0/G1期異時(shí)相Cyclin B1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡
　　 目的：利用四環(huán)素誘導(dǎo)Cyclin B1可控表達(dá)的293單克隆細(xì)胞株來證明G0/G1 期異時(shí)相Cyclin B1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡
　　 方法：挑選出一個(gè)最優(yōu)的T

5、hymidine的濃度，其能最大程度的阻滯細(xì)胞于G0/G1期。接著，將細(xì)胞大量阻滯在G0/G1 期，然后在阻滯好的細(xì)胞中加入微量的四環(huán)素誘導(dǎo)Cyclin B1表達(dá)48 小時(shí)，最后用Annexin V-PI 雙標(biāo)法和API法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的量和凋亡的周期特異性，同時(shí)用Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶1(Cdk1)的活性情況。
　　 結(jié)果：用Thymidine 處理細(xì)胞后，絕大部分細(xì)胞都同步化在G0/G1 期。在四環(huán)

6、素誘導(dǎo)Cyclin B1表達(dá)48 小時(shí)后，誘導(dǎo)組比非誘導(dǎo)組的Cyclin B1 蛋白總量明顯增加，細(xì)胞凋亡明顯增加。此時(shí)，活性的Cdk1 (Thr 161 磷酸化)蛋白量較未誘導(dǎo)組也明顯增加。
　　 結(jié)論：G0/G1 期異時(shí)相Cyclin B1的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分：Cyclin B1導(dǎo)致的G0/G1期特異性細(xì)胞凋亡機(jī)制的探索
　　 目的：探索在由Cyclin B1 導(dǎo)致的G0/G1 期特異的細(xì)胞

7、凋亡中，除了激活Cdk1外，Cyclin B1 還可能和哪些蛋白相互作用，或者Cyclin B1/Cdk1 能通過磷酸化哪些蛋白質(zhì)起作用。
　　 方法：我們篩選好的單克隆細(xì)胞株在加入四環(huán)素后能表達(dá)帶有Myc和His標(biāo)簽的外源性Cyclin B1。將未誘導(dǎo)的和用四環(huán)素誘導(dǎo)48 小時(shí)的細(xì)胞裂解后，分別加入10μgMyc的單克隆抗體，用免疫沉淀(immune precipitation，IP)的方法將可能和Cyclin B1結(jié)合的蛋白

8、沉淀下來，接著將蛋白混合物進(jìn)行SDS PAGE 電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色法和銀染法找出未誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組之間的差異蛋白，然后用質(zhì)譜(mass spectrometry,MASS)分析出差異蛋白的名稱。
　　 結(jié)果：用質(zhì)譜鑒定出的蛋白有細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶一(Cyclin-dependentkinase 1，Cdk1),細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶二(Cyclin-dependent kinase 2，Cdk2)，有絲分裂阻滯缺失樣蛋白一

9、(Mitotic arrest deficient-like protein 1，MAD1-like 1，MAD1L1)和熱休克蛋白八(heat shock 70kDa protein 8 isoform 1)。
　　 結(jié)論：在由Cyclin B1 導(dǎo)致的G0/G1 期特異的細(xì)胞凋亡中，除了磷酸化Thr 161 殘基激活Cdk1后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡外，Cyclin B1(Cyclin B1/Cdk1)與Cdk2、MAD1L1和Hsp7