1、體細胞克隆技術是一種具有廣闊應用前景的家畜遺傳改良技術，故而成為當今生物技術的研究熱點。然而，目前體細胞克隆的效率還很低，主要表現(xiàn)在克隆胚胎發(fā)育率低，移植后妊娠率低、流產(chǎn)率高、胎盤異?；虺錾鷥后w重過大等問題，使得體細胞克隆技術在實際生產(chǎn)應用中受到限制。有研究表明，異常的表觀遺傳修飾是克隆胚胎效率低的主要原因，而組蛋白乙?；虳NA甲基化修飾是表觀遺傳修飾的兩個重要方面。因此，本研究系統(tǒng)探討了組蛋白去乙?；敢种苿㏒criptaid對水牛

2、體細胞核移植重構胚發(fā)育潛能及胚胎表觀遺傳修飾的影響及其對克隆胚胎合子基因激活的影響，同時研究了Scriptaid對水牛轉基因效果的影響，以期進一步提高水牛體細胞克隆和轉基因克隆的效率。具體的研究結果如下。
　　1.本研究首先采用醋酸地衣紅染色法確定了水牛卵母細胞不同成熟培養(yǎng)時間的核相分布情況，然后利用細胞免疫組化技術和定量PCR技術分別分析水牛卵母細胞組蛋白乙酰化修飾的情況，并探討Scriptaid對卵母細胞組蛋白乙?；揎椀挠绊?/p>

3、，從而建立一種檢測水牛卵母細胞組蛋白乙酰化修飾相關蛋白和基因表達的技術方法。結果顯示:體外成熟培養(yǎng)0h時大約91.8％的卵母細胞處于GV期，培養(yǎng)9h時，有83.3％的卵母細胞發(fā)生GVBD;隨著成熟培養(yǎng)時間延長，到達15h時，卵母細胞處在MⅠ期的比率達到72.5％，培養(yǎng)至22 h時，有59.6％的卵母細胞進入MⅡ期。水牛卵母細胞體外成熟過程中組蛋白H3K18乙?；綇腉V期到GVBD期開始升高，MⅠ期突然消失，MⅡ期重新升高，在第一極體

4、上也觀察到熒光信號，經(jīng)500 nmol/L Scriptaid處理水牛卵母細胞24 h，MⅠ期的卵母細胞組蛋白H3K18乙?；斤@著增強(P＜0.05)，呈現(xiàn)出從GV期到GVBD期開始升高，到MⅠ時期下降，而后到MⅡ期乙?；街匦律叩内厔?。而CBP，p300和HAT1基因在水牛卵母細胞成熟過程各個時期(GV，GVBD，MⅠ，MⅡ)的表達水平呈現(xiàn)出升高的趨勢，HDAC1和HDAC2基因的表達水平從GV到MⅡ期顯示出先升高后下降的波浪

5、線趨勢;而經(jīng)500 nmol/L Scriptaid處理水牛卵母細胞24 h后，CBP，p300和HAT1基因在各個時期的表達水平顯著提高(P＜0.05)，仍表現(xiàn)出上升的趨勢;HDAC2基因的表達水平在MⅡ期顯著地降低(P＜0.05)，從GV到MⅡ期表現(xiàn)出先升高后下降的波浪線趨勢，而HDAC1基因在各個時期的表達呈現(xiàn)出從GV期到MⅠ期先下降，而后到MⅡ期升高的趨勢。
　　2.研究了Scriptaid處理水牛SCNT胚胎后對其發(fā)育能

6、力及組蛋白乙?；揎椀挠绊?。水牛SCNT胚胎經(jīng)不同濃度Scriptaid(0，250，500，750 nmol/L)處理12 h后，500 nmol/L Scriptaid處理組的囊胚發(fā)育率顯著高于未處理組(19.2％ vs10.3％，P＜0.05)。當水牛SCNT胚胎用500 nmol/L Scriptaid處理不同時間(0h，6h，12h，18h，24 h，30h和36h)時，24h組的囊胚發(fā)育率(28.2％)顯著高于對照組(13.

7、6％)，6h組(15.5％)和12 h組(17.4％)。不同類型胚胎組蛋白H3K18乙酰化修飾和整體DNA甲基化修飾的細胞免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，SCNT組胚胎各個時期（2-細胞，8-細胞，桑椹胚和囊胚）的H3K18乙?；斤@著低于IVF組(P＜0.05)，而DNA甲基化的水平顯著高于IVF組和PA組的胚胎(P＜0.05)，但SCNT胚胎500 nmol/L Scriptaid處理組的各個時期組蛋白H3K18乙酰化水平顯著地高于SCNT組(

8、P＜0.05)，除8-細胞時期外，其它三個時期胚胎乙?；骄咏贗VF組的水平(P＞0.05)，而胚胎整體DNA甲基化修飾水平顯著地降低(P＜0.05)，且其囊胚時期胚胎DNA甲基化水平接近于IVF組(P＞0.05)。組蛋白乙酰化(CBP，p300，HAT1，HDAC1和HDAC2)、DNA甲基化(Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b)和胚胎發(fā)育（Oct-4，Nanog，Cx43和Cdx2）相關基因表達水平的熒光定量PCR分析結果

9、顯示:Scriptaid處理SCNT胚胎組在8-細胞期的CBP，HDAC1和HDAC2基因表達水平接近于IVF組，Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b基因的表達水平顯著降低（P＜0.05），Dnmt1基因表達水平接近IVF組(P＞0.05);在桑椹期的Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b基因表達水平顯著地提高(P＜0.05)，Dnmt1基因和CBP基因的表達水平接近IVF組(P＞0.05);在囊胚期的Dnmt3a基因表達水平顯著降低

10、，Dnmt3a基因和HAT1基因的表達水平接近IVF組(P＞0.05)。PA組各個時期胚胎的CBP，p300，HAT1和HDAC1基因表達量處于較高水平。此外，Scriptaid處理SCNT胚胎組的各個時期胚胎的Oct-4基因表達水平顯著提高，8-細胞期和囊胚期的Nanog基因、桑椹期的Cx43基因，以及囊胚期的Cdx2基因的表達水平亦顯著高于SCNT組(P＜0.05)，接近于IVF組的表達水平。
　　3.探討了Scriptaid

11、處理水牛SCNT胚胎對其合子基因激活的影響。采用轉錄抑制劑25μg/mlα-amanition可將水牛胚胎阻滯于8-16細胞時期。透射電子顯微鏡技術觀察各個時期（4-細胞，8-細胞和桑椹期）胚胎細胞核核仁變化情況的結果顯示:IVF組胚胎在4-細胞時期核仁呈現(xiàn)出核仁前體(Nucleolus precursor body，NPB)形式，8-細胞時期NPB周圍出現(xiàn)網(wǎng)狀結構，到桑椹期NPB消失，形成具有轉錄功能的網(wǎng)狀結構;而8-細胞時期的SCN

12、T組胚胎NPB周圍沒有形成網(wǎng)狀結構;但經(jīng)500nmol/L Scriptaid處理水牛核移植重構胚胎24 h，可觀察到8-細胞時期核移植胚胎細胞核中的NPB周圍出現(xiàn)低電子密度的網(wǎng)狀結構，開始行使轉錄功能。各個發(fā)育時期（2-細胞，4-細胞，8-細胞和桑椹期）胚胎的RNA PolⅡ蛋白和核纖蛋白Fibdllarin表達細胞免疫組化技術檢測結果發(fā)現(xiàn)，IVF胚胎在2-細胞和4-細胞時期未檢測到RNA PolⅡ蛋白和核纖蛋白Fibrillarin

13、熒光信號，8-細胞階段開始發(fā)現(xiàn)熒光信號，而SCNT胚胎在桑椹期才開始檢測到這兩個蛋白的熒光信號，經(jīng)Scriptaid處理的SCNT胚胎在8-細胞階段開始檢測到RNA PolⅡ蛋白和核纖蛋白Fibrillarin微弱的熒光信號。胚胎合子基因激活標志基因(eIF-3a和TRC)表達的熒光定量PCR檢測結果顯示:IVF胚胎的eIF-3a和TRC基因從2-細胞到8-細胞期先升高，從8-細胞到桑椹期開始急劇地降低，而SCNT胚胎的eIF-3a基因

14、從2-細胞到桑椹期呈現(xiàn)一直降低的趨勢;經(jīng)Scriptaid處理的SCNT胚胎，除桑椹期外，其他三個時期的eIF-3a和TRC基因表達水平顯著高于IVF組和SCNT組(P＜0.05)，呈現(xiàn)出波浪形表達趨勢，在8-細胞時期表達水平最高;SCNT組以及Scriptaid處理組胚胎的TRC基因表達水平均低于IVF組。
　　4.探討了Scriptaid對水牛轉基因克隆效率的影響。水牛轉基因胎兒成纖維細胞用各種濃度(0，250，500，750

15、 nmol/L)的Scriptaid處理不同時間(0，24h，48h，72h)后，經(jīng)250 nmol/L或500 nmol/L Scriptaid處理72 h的轉基因細胞在熒光顯微鏡下觀察到的GFP熒光更強。熒光定量PCR的分析結果亦顯示，250 nmol/L Scriptaid處理72 h的轉基因細胞，其GFP基因的表達水平顯著地高于其它各組的表達水平(P＜0.05)。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，250 nmol/L處理72 h組、500 n

16、mol/L處理48 h或72 h組，以及750nmol/L處理48 h組的GFP-陽性細胞比例顯著高于250 nmol/L處理48 h組、500 nmol/L和750 nmol/L處理24 h組(79.8％，80.9％，80.1％，80.8％ vs73.2％，73.1％，68.5％，P＜0.05)，但與對照組和其他處理組之間差異不顯著。轉基因細胞外源基因EF-1A啟動子區(qū)的甲基化程度重亞硫酸氫鹽—測序檢測結果顯示:Scriptaid處理

17、顯著降低轉基因細胞的EF-1A啟動子區(qū)甲基化水平(P＜0.05)，各處理組之間差異不顯著(P＞0.05)。用經(jīng)250 nmol/L Scriptaid處理72 h的水牛轉PRL基因胎兒成纖維細胞作為供體細胞構建SCNT胚胎，再用500 nmol/L Scriptaid處理SCNT胚胎24 h，其囊胚發(fā)育率顯著高于對照組（31.3％ vs20.4％，P＜0.05），且其移植后的妊娠率顯著提高(22.9％ vs11.1％)，并有1頭已順利出