1、隨著生活質(zhì)量水平的提高，肉制品生產(chǎn)量達(dá)到了人類(lèi)歷史上前所未有的數(shù)量。肉制品的摻雜、摻假行為，動(dòng)物疫病蔓延，宗教對(duì)肉制品的禁忌以及珍稀動(dòng)物保護(hù)等問(wèn)題，已受到當(dāng)前社會(huì)熱切關(guān)注。利甩PCR技術(shù)鑒別動(dòng)物源性成分來(lái)源是打擊違法違規(guī)行為的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也是保護(hù)珍稀動(dòng)物的有力保障。本文通過(guò)遺傳生物學(xué)方法，力爭(zhēng)鑒別動(dòng)物源性成分來(lái)源于不同物種間和在不同品種間。同時(shí)也利用PCR技術(shù)精確快速的特性，來(lái)對(duì)動(dòng)物源性成分及含量進(jìn)行定性分析和定量檢測(cè)。
　　本

2、實(shí)驗(yàn)的研究分為三部分:(1)基于國(guó)際生命條碼聯(lián)盟(CBOL，the Consortiumfor the Barcode of Life)提出的Barcoding技術(shù)所確定的序列區(qū)域。通過(guò)NCBI查詢(xún)和Oligo6.0和Primer5.0軟件的篩選，得到了COⅠ基因的通用引物，可以擴(kuò)增牛、羊、豬、家禽、家兔、犬和貓七個(gè)物種的COⅠ基因片段。然后使用Vector NTI.11.5軟件，篩選了AfaⅠ做為本試驗(yàn)的限制性?xún)?nèi)切酶。結(jié)果顯示，牛、羊

3、、豬、家禽、家兔、犬和貓七個(gè)物種能被AfaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶切成不同片段，從而鑒別出不同物種的動(dòng)物源性成分。(2)根據(jù)mtDNA中COⅠ基因序列的保守性和適度進(jìn)化特性，設(shè)計(jì)了Realtime-PCR的熔解曲線法，檢測(cè)豬源性成分的來(lái)源，即加快了檢測(cè)的速度，也增加了同時(shí)檢測(cè)樣品的數(shù)量。同時(shí)，為了避免食品中PCR抑制劑的影響，本試驗(yàn)設(shè)置GCG基因125bp的純化片段為內(nèi)參照，控制假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，豬和GCG基因的特異性產(chǎn)物

4、分別在79.2℃和75℃有特異性熔解峰。設(shè)置牛、羊、家禽、家兔、鼠和空白對(duì)照，均無(wú)特異性擴(kuò)增。測(cè)序結(jié)果表明，該豬特異性引物的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為245bp，其核酸序列與NCBI中相應(yīng)序列吻合。0.001％為該方法的LOV值。(3)利用功能性蛋白基因在不同品種間的差異來(lái)鑒別動(dòng)物源性成分的來(lái)源。首先，我們要選擇遺傳高度保守性遺傳的品種，本實(shí)驗(yàn)選擇了五指山豬(WZSP)和杜洛克豬作為鑒別對(duì)象，通過(guò)文獻(xiàn)了解到WZSP和普通體型豬在GHR基因上有多個(gè)

5、SNP位點(diǎn)，其中有兩個(gè)SNP位點(diǎn)是有意突變，且改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，影響了生長(zhǎng)激素的作用。豬的GHR基因序列是根據(jù)NCBI上SusCrafa物種查詢(xún)得到的，根據(jù)已報(bào)道的引物。擴(kuò)增WZSP和杜洛克豬的GHR基因得到序列產(chǎn)物，再根據(jù)信息利用Vector NTI.11.5軟件篩選內(nèi)切酶PstⅠ。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)內(nèi)切酶PstⅠ消化酶切后WZSP的GHR基因擴(kuò)增產(chǎn)物的序列會(huì)出現(xiàn)2條帶，而普通體型豬杜洛克則出現(xiàn)一條帶，說(shuō)明該方法成功的鑒別出了動(dòng)物源

6、性成分在不同品種間的來(lái)源。通過(guò)混合檢測(cè)，該方法的檢出限(LOD)為5％。LOD值較高的原因可能是功能性蛋白基因與線粒體基因相比，在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)基因數(shù)量上要少很多，且GHR基因序列較長(zhǎng)，容易降解斷裂。
　　該實(shí)驗(yàn)的目的主要是為了利用DNA-Barcoding技術(shù)建立同時(shí)鑒別不同物種源性成分以及批量檢測(cè)豬源性成分的方法。然后在鑒別物種的基礎(chǔ)上，利用GHR基因的SNPs位點(diǎn)來(lái)鑒別品種五指山豬源性的成分。同時(shí)也為鑒定機(jī)構(gòu)制定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)