1、本文對海人酸誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激致神經(jīng)元的毒性機制及褪黑素的保護作用進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：海人酸誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導神經(jīng)元凋亡及褪黑素的保護作用。
　　目的：在C57BL/6J小鼠體內(nèi)和Neuro-2a細胞中探討海人酸（kainic acid，KA）誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）介導神經(jīng)元凋亡的分子機制以及褪黑素（melatonin，MT）的保護作用。

2、r>　　方法：首先，將C57BL/6J小鼠分為六組，即①對照（CON）組；②海人酸（KA）組；③海人酸與褪黑素共處理（KA+MT）組；④褪黑素（MT）組；⑤海人酸與4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，PBA）共處理（KA+PBA）組；⑥4-苯基丁酸（PBA）組。用實時定量 PCR檢測方法檢測 ERS標志分子 Bip和 CHOP以及ERS特異性的凋亡分子Caspase-12及其下游效應分子Caspase-3 mRNA水

3、平表達情況，用甲苯胺藍染色方法檢測小鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)結構，用水迷宮檢測方法檢測小鼠空間記憶能力。其次，在 Neuro-2a細胞中驗證上述動物水平的實驗結果，并進一步在Neuro-2a細胞中通過鈣離子熒光探針Fura-2/AM和熒光成像系統(tǒng)檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度，用熒光酶標儀檢測Calpain的活性變化。
　　結果：①KA刺激C57BL/6J小鼠后，ERS標志性分子Bip和CHOP在mRNA水平明顯上調(diào)，ERS特異性凋亡分子 Ca

4、spase-12及其下游細胞凋亡效應分子Caspase-3在mRNA水平表達均顯著升高；MT可顯著抑制C57BL/6J小鼠體內(nèi)KA誘發(fā)的ERS，對抗KA誘導ERS介導的神經(jīng)元凋亡，同時MT對KA引起的小鼠空間記憶功能障礙有顯著的保護作用。②在體外 Neuro-2a細胞中驗證了上述結果：與對照組相比，KA作用3h后Neuro-2a細胞中Bip，CHOP，Caspase-12，Caspase-3在mRNA水平表達明顯增強，細胞內(nèi)Ca2+濃度

5、顯著增加，同時Calpain酶活性明顯增加；MT處理Neuro-2a細胞后可有效抑制KA誘發(fā)的ERS及ERS介導的神經(jīng)元凋亡，同時MT可有效抑制KA引起的細胞內(nèi)Ca2+濃度及Calpain活性的增加。
　　結論：在C57BL/6J小鼠和Neuro-2a細胞中，KA可誘發(fā)ERS途徑介導的神經(jīng)元凋亡；MT通過抑制ERS進而抑制神經(jīng)元凋亡。
　　第二部分：海人酸引起tau蛋白過度磷酸化的分子機制及褪黑素的保護作用。
　　目的

6、：在 C57BL/6J小鼠體內(nèi)和 HEK293/Tau細胞中探討海人酸（KA）誘導的ERS引起的tau蛋白過度磷酸化以及MT的保護作用。
　　方法：首先，將HEK293/Tau細胞分為四組，即①對照（CON）組；②海人酸（KA）組；③海人酸與褪黑素共處理（KA+MT）組；④褪黑素（MT）組。采用Western blotting方法檢測tau蛋白在ps202和ps404位點的磷酸化水平，并通過放射性同位素γ-32P標記的酶活性測定法

7、檢測磷酸化激酶GSK3和CDK5的活性變化情況，同時用熒光酶標儀檢測 Calpain的活性變化。其次，在C57BL/6J小鼠海馬組織內(nèi)采用免疫組織化學和Western blotting方法檢測tau蛋白ps202和ps404位點磷酸化水平，驗證上述細胞水平實驗結果。
　　結果：①KA處理HEK293/Tau細胞后tau蛋白在ps202和ps404位點磷酸化水平顯著增加，同時增加GSK3，CDK5和Calpain活性；MT可對抗KA