1、帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其主要病理特點為黒質(zhì)致密部(Substantianigraparscompact,SNpc)含黑素的多巴胺（Dopamine,DA）能神經(jīng)元選擇性變性缺失，主要臨床特點為靜止震顫，肌僵直，姿態(tài)不穩(wěn)以及運動緩慢。目前，PD的病因和發(fā)病機制尚不明確。但大量研究已經(jīng)表明氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙與PD的發(fā)病機制密切相關(guān)。
　　6-羥基多巴胺（6-hydr

2、oxydopamine,6-OHDA）是DA的一種羥化衍生物，廣泛的用于PD體內(nèi)外模型的建立。其具有神經(jīng)毒性并且能夠誘導體內(nèi)外DA能神經(jīng)元的凋亡。PC12細胞株來源于大鼠嗜鉻細胞瘤，它具有類似于多巴胺合成、代謝和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的功能，與中腦多巴胺能神經(jīng)元特性十分接近。
　　二苯乙烯苷（2,3,5,4-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG）是從中草藥何首烏中提取的有效活性成分之一。其具有抗氧

3、化，抗炎，以及改善學習記憶的作用。有研究已經(jīng)證實TSG可改善老年癡呆小鼠的學習記憶能力，具有神經(jīng)保護作用。最近，我們的研究表明TSG對MPP+誘導的PC12細胞凋亡具有保護作用。
　　為了進一步研究TSG的神經(jīng)保護作用，本研究選擇與DA能神經(jīng)元特性相似的PC12細胞和具有神經(jīng)毒素的6-OHDA建立體外PD模型，觀察TSG對6-OHDA誘導的PC12細胞凋亡是否有保護作用，并對其作用機制做初步探討。
　　【目的】：
　　

4、1.用神經(jīng)誘導因子處理細胞使之具有類似DA的性能。
　　2．建立PD體外模型，篩選出6-OHDA誘導PC12細胞凋亡的有效濃度和TSG對6-OHDA誘導PC12細胞凋亡的有效保護濃度；
　　3．觀察TSG對6-OHDA誘導的PC12細胞凋亡的影響；
　　4．研究TSG減輕6-OHDA誘導PC12細胞凋亡可能的機制。
　　【方法】：
　　1.設(shè)立空白對照組，25，75，100，125，150，200和300μ

5、mol/L6-OHDA濃度組作用于PC12細胞24h，篩選6-OHDA實驗處理有效濃度，篩選出6-OHDA有效濃度為75μmol/L；設(shè)立空白對照組，1，5，10，20，50，100，200μmol/LTSG濃度組作用PC12細胞24h，觀察TSG單獨處理細胞對細胞的影響；設(shè)立空白對照組，1，5，10，20，50，100，200μmol/LTSG濃度組作用PC12細胞24h，再用6-OHDA（75μmol/L）處理24h，篩選TSG實驗

6、處理有效濃度，篩選出最佳TSG預處理組濃度為10，20，50μmol/L。
　　2.設(shè)立正常對照組，單獨TSG處理組，6-OHDA處理組，不同濃度TSG預處理組（10，20，50μmol/L），用MTT比色法檢測細胞活力；Hoechst33258染色觀察細胞核形態(tài)變化；流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡百分率；TUNEL染色觀察細胞DNA斷裂情況；
　　3.通過全自動熒光酶標儀檢測細胞內(nèi)ROS和NO水平；
　　4.通過E

7、lisa檢測試劑盒檢測3-NT蛋白水平；
　　5.通過WesternBlot法檢測細胞中iNOS和nNOS蛋白的表達水平；
　　【結(jié)果】：
　　1.MTT比色法檢測觀察，與對照組相比，75μmol/L6-OHDA處理PC12細胞24h后細胞活力為（52.6±1.3）％（P<0.01）。TSG預處理細胞24h后，再用75μmol/L6-OHDA處理24h，與6-OHDA組（52.6±1.3）％相比，10，20，50μmo

8、l/LTSG預處理組細胞活力分別上升為（66.6±3.2）％（P<0.01），（73.0±1.6）（P　　2.Hoechst33258染色觀察到，正常細胞核顯示藍色，均勻淡染，邊緣光滑整齊，6-OHDA處理組細胞核呈致密濃染，細胞

9、染色質(zhì)皺縮，顯示亮藍熒光，甚至可見細胞核斷裂，呈現(xiàn)致密的顆粒熒光。而用TSG（10，20和50μmol/L）預處理細胞后，上述細胞凋亡特點明顯改善。單獨TSG處理組對細胞形態(tài)學無明顯影響。
　　3.FCM結(jié)果顯示，正常組，僅TSG組，6-OHDA處理組，TSG（10，20和50μmol/L）預處理組凋亡細胞百分率分別為1.8％，1.6％，35.2％，30.7％和18.7％，13.6％。
　　4.TUNEL染色顯示，與正常對照

10、組（4.8±1.4）％相比，6-OHDA組TUNEL陽性細胞數(shù)增加到（30.6±2.0）％（P<0.01），而TSG（10，20和50μmol/L）組TUNEL陽性細胞數(shù)則分別下降為（22.8±1.0）％（P<0.01），（19.4±0.9）（P<0.01）和（11.6±1.1）％（P<0.01）。僅TSG組對細胞形態(tài)無明顯影響。
　　5.全自動熒光酶標儀檢測ROS和NO觀察到，與正常對照組細胞內(nèi)ROS水平（99.8±3.1）％相

11、比，6-OHDA組細胞內(nèi)ROS水平增加到（178.4±9.4）％（P<0.01），而TSG（10，20和50μmol/L）預處理組細胞內(nèi)ROS水平則分別下降為（169.6±8.8）％，（156.0±9.1）％（P<0.01），（119.2±7.4）％（P<0.01）；僅TSG組對細胞內(nèi)ROS影響不明顯。與正常對照組細胞內(nèi)NO水平（98.8±4.1）％相比，6-OHDA組細胞內(nèi)NO水平增加到（308.6±23.6）％（P<0.01），而T

12、SG（10，20和50μmol/L）預處理組細胞內(nèi)NO水平則分別下降為（287.6±23.2）％，（236.0±34.8）％，（158.0±14.6）％（P<0.01），僅TSG處理對細胞內(nèi)NO影響不明顯。
　　6.Elisa檢測試劑盒檢測3-NT顯示，與正常對照組細胞內(nèi)3-NT水平（4.4±0.3）％相比，6-OHDA組細胞內(nèi)3-NT水平增加到（18.2±0.8）％（P<0.01），而TSG（10，20和50μmol/L）預處理

13、組細胞內(nèi)3-NT水平則分別下降為（16.7±0.9）％，（14.6±1.3）％（P<0.05），（10.1±0.7）％（P<0.01），僅TSG處理對細胞內(nèi)3-NT影響不明顯。
　　7.WesternBlot方法檢測結(jié)果表明，TSG（10，20和50μmol/L）預處理組iNOS和nNOS表達水平較6-OHDA處理組明顯依次減弱。
　　【結(jié)論】：
　　1.在一定濃度范圍內(nèi)，TSG以劑量依賴的方式能夠減輕6-OHDA誘導