1、第1部分構(gòu)建及驗(yàn)證CREB-1干擾與表達(dá)質(zhì)粒載體
　　目的:分別構(gòu)建及獲取有效的CREB-1干擾與過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體,為實(shí)驗(yàn)提供相關(guān)的干預(yù)材料及基礎(chǔ)。
　　方法:利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原理,通過(guò)生物信息學(xué)軟件及CREB-1基因mRNA序列,設(shè)計(jì)3條理論上能靶向抑制CREB-1表達(dá)的莖環(huán)狀shRNA,分別命名為sh-CREB1-1、sh-CREB1-2與sh-CREB1-3。以pGenesil-1.1為載體,含增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP

2、),通過(guò)基因工程技術(shù)合成含有上述shRNA的質(zhì)粒,另合成針對(duì)內(nèi)參GADPH的sh-GADPH與不針對(duì)任何基因的空白質(zhì)粒sh-BLANK。CREB-1表達(dá)載體pRSV-CREB-1由Michael E.Greenberg教授贈(zèng)與,常規(guī)從紙片中提取及擴(kuò)增,并行DNA測(cè)序以初步驗(yàn)證其序列。將以上6組質(zhì)粒分別用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至HSC-T6,轉(zhuǎn)染后12h、24h、36h、48h、60h、72h在熒光顯微鏡下觀察GFP初步判斷轉(zhuǎn)染效果及效率,然后分別

3、提取細(xì)胞總蛋白,Western Blot檢測(cè)CREB-1及內(nèi)參GAPDH蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:pRSV-CREB-1表達(dá)載體經(jīng)DNA測(cè)序后與GenBank中CREB-1堿基序列相比對(duì),其編碼CREB-1蛋白氨基酸的堿基一致率達(dá)93.4％,并且CREB-1磷酸化關(guān)鍵位點(diǎn)(S133)的氨基酸區(qū)域完全一致。含有EGFP的質(zhì)粒組細(xì)胞從轉(zhuǎn)染后24小時(shí)到72小時(shí)均能觀察到綠色熒光,轉(zhuǎn)染后48h熒光最強(qiáng),其轉(zhuǎn)染效率約為15％～20％。轉(zhuǎn)染

4、后48h,Western Blot結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染sh-BLANK的空白組相比,sh-CREB1-1組、sh-CREB1-2組、sh-CREB1-3組、pRSV-CREB-1組HSC中CREB-1蛋白表達(dá)分別為0.61±0.17(P<0.05)、0.55±0.07(P<0.01)、0.94±0.27(P>0.05)、1.60±0.11(P<0.05);同時(shí),與空白組相比,sh-GAPDH組的內(nèi)參GAPDH表達(dá)明顯下降0.20±0.08(

5、P<0.01)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建及獲取CREB-1干擾及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體sh-CREB1與pRSV-CREB-1。3條干擾載體中sh-CREB1-2的抑制效果最佳,可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的首選干擾載體。sh-GAPDH組的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)本轉(zhuǎn)染體系有效可行。
　　第2部分磷酸化CREB-1誘導(dǎo)HSC中內(nèi)源性TGF-β3的分泌
　　背景與目的:在大鼠腸上皮細(xì)胞中,存在CREB-1與TGF-β3反饋分泌環(huán),即兩者可相互促進(jìn)對(duì)方的表

6、達(dá)。前期研究顯示外源性TGF-β3能夠誘導(dǎo)HSC中CREB-1蛋白的表達(dá)及促進(jìn)該蛋白的磷酸化,而HSC中CREB-1是否也存在促進(jìn)TGF-β3的通路目前尚不明確,本部分實(shí)驗(yàn)為探討CREB-1及其磷酸化狀態(tài)對(duì)HSC中內(nèi)源性TGF-β3分泌的影響。
　　方法:利用上一部分工作所建立的轉(zhuǎn)染體系及篩選的CREB-1干擾載體sh-CREB1-2、表達(dá)質(zhì)粒pRSV-CREB1及空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC,轉(zhuǎn)染后46小時(shí)換不含血清的培養(yǎng)基液并加(+)或

7、不加(-)入外源性TGF-β3處理,2小時(shí)后留取細(xì)胞外液及提取細(xì)胞胞漿和胞核蛋白,Western Blot法檢測(cè)HSC胞漿蛋白中CREB-1及胞核蛋白中磷酸化CREB-1(p-CREB-1)蛋白的表達(dá),ELISA法檢測(cè)細(xì)胞外液中內(nèi)源性TGF-β3的分泌。另外,采用抑制CREB-1磷酸化試劑H89與促進(jìn)CREB-1磷酸化試劑Forskolin(毛喉素)分別處理HSC細(xì)胞,檢測(cè)處理后細(xì)胞核蛋白中p-CREB-1表達(dá)及細(xì)胞外液中TGF-β3的

8、分泌。
　　結(jié)果:與空白轉(zhuǎn)染BLANK(-)組相比,sh-CREB1-2(-)組胞漿蛋白中的CREB-1及胞核蛋白中的p-CREB-1表達(dá)降低,分別為0.63±0.11(P<0.05)與0.93±0.10(P>0.05),細(xì)胞外TGF-β3分泌減少為0.81±0.18(P>0.05);pRSV-C(-)組中CREB-1及p-CREB-1蛋白表達(dá)上升為1.66±0.14(P<0.05)與1.23±0.14(P>0.05),細(xì)胞外TG

9、F-β3分泌為1.13±0.07(P>0.05)。與BLANK(+)組相比,sh-CREB1-2(+)組胞漿蛋白中的CREB-1及胞核蛋白中的p-CREB-1表達(dá)亦降低,分別為0.45±0.08(P<0.05)與0.32±0.08(P<0.05),細(xì)胞外TGF-β3分泌減少為0.35±0.05(P<0.05);pRSV-C(+)組胞漿蛋白中的CREB-1及胞核蛋白中的p-CREB-1表達(dá)升高,分別為2.19±0.08(P<0.05)與2

10、.75±0.14(P<0.05),細(xì)胞外TGF-β3分泌增多為2.56±0.19(P<0.05)。與空白對(duì)照(Control)組相比,H89組p-CREB-1蛋白表達(dá)降低為0.53±0.07(P<0.05),細(xì)胞外TGF-β3分泌減少為0.44±0.05(P<0.05);Forskolin組p-CREB-1蛋白表達(dá)升高為2.13±0.09(P<0.05),細(xì)胞外 TGF-β3分泌增多達(dá)3.76±0.11(P<0.05)。
　　結(jié)論