1、隨著規(guī)?；?、集約化飼養(yǎng)方式的普及，現(xiàn)代牧業(yè)中高產(chǎn)奶牛疾病的疾病增多明顯，嚴(yán)重危害奶牛業(yè)健康發(fā)展，而奶牛亞急性瘤胃酸中毒（SARA）是高產(chǎn)奶牛的常見疾病，每年造成巨大損失。奶牛亞急性瘤胃酸中毒時(shí)，瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的大量組胺是導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生各種炎癥的重要因素。炎性因子COX-2、IL-6、TNF-α及NF-κB信號(hào)通路與炎癥的產(chǎn)生密切相關(guān)。為研究奶牛瘤胃酸中毒時(shí)血液內(nèi)組胺濃度的變化及對(duì)奶牛炎性因子及炎性信號(hào)通路的影響，本試驗(yàn)通過對(duì)健康奶牛飼喂高精料

2、日糧，誘發(fā)亞急性瘤胃酸中毒，促使瘤胃內(nèi)大量產(chǎn)生組胺，手術(shù)安裝血管瘺管采集門靜脈和肝靜脈血液樣品，通過檢測血液中組胺含量及COX-2含量，并通過RT-PCR對(duì)在體肝臟中的COX-2、NF-κB、IL-6、TNF-α表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量和絕對(duì)定量檢測，為組胺對(duì)奶牛炎性信號(hào)通路產(chǎn)生的影響提供一定的依據(jù)。
　　1.不同日糧精粗比對(duì)奶牛組胺和COX-2產(chǎn)生的影響
　　隨機(jī)選取6頭泌乳期的成年健康奶牛，隨機(jī)分組，采用2×2的拉丁方設(shè)計(jì)，

3、對(duì)兩組奶牛分別飼喂等能等氮的高精料日糧和低精料日糧，誘發(fā)亞急性瘤胃酸中毒，手術(shù)安裝血管瘺管采集門靜脈和肝靜脈血液樣品，組胺Elisa試劑盒檢測血液中組胺含量，牛COX-2 Elisa試劑盒檢測血液中COX-2的含量。結(jié)果表明，高精料組奶牛門靜脈內(nèi)組胺濃度較對(duì)照組均有所增加，高精料組組胺平均濃度（19.99±0.21 ug/L）較低精料組（18.12±0.35ug/L）差異顯著(P＜0.05)，而高精料組血液中平均COX-2濃度（38.3

4、6±0.32ng/ml）較低精料組（12.45±0.41ng/ml）也有顯著提升(p＜0.05)
　　2.不同日糧精粗比下組胺差異對(duì)COX-2、NF-κB、IL-6、TNF-α基因表達(dá)的影響
　　為了解不同日糧狀況下奶牛體內(nèi)組胺含量變化對(duì)肝臟內(nèi)COX-2、NF-κB、IL-6和TNF-α基因表達(dá)的影響，從分子水平研究奶牛肝臟對(duì)組胺反應(yīng)的作用機(jī)理，本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測了高精料日糧狀況下奶牛肝

5、臟內(nèi)COX-2、NF-κB、IL-6核TNF-α基因mRNA的表達(dá)變化，并分析了其與高精料時(shí)組胺濃度變化的關(guān)系。結(jié)果顯示，高精料組NF-κB、COX-2、IL-6和TNF-α的表達(dá)較低精料組均有升高，且NF-κB、COX-2、IL-6和TNF-α四個(gè)基因的表達(dá)有顯著升高(p＜0.05)。本試驗(yàn)證明了奶牛SARA中血液內(nèi)組胺濃度的升高可誘導(dǎo)肝臟對(duì)其轉(zhuǎn)化和降解的效率增加，且組胺含量的增高可誘導(dǎo)奶牛肝臟中NF-KB信號(hào)通路的打開，進(jìn)而導(dǎo)致CO

6、X-2等炎性基因表達(dá)。
　　3.不同日糧精粗比下COX-2表達(dá)的絕對(duì)定量檢測
　　通過穿刺分別采取高精料組奶牛和低精料組奶牛的肝臟樣品，提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)后使用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行回收，得到的目的DNA連接19T-vector，之后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α進(jìn)行大量培養(yǎng)。培養(yǎng)的菌液DNA測序后證實(shí)目的DNA成功導(dǎo)入后，使用試劑盒提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋10、102、103、104、10