1、背景：
　　難愈性傷口嚴重影響了病人的生理健康和生活質(zhì)量,盡管已有的分子水平的治療方法為解決此難題提供了很多有效的方法,但并未達到預(yù)期效果。因此研究促進傷口愈合的組織因子,具有重要的臨床治療意義。傷口愈合是一個多細胞、細胞因子及細胞外基質(zhì)參與的過程,它受機體多種因素緊密調(diào)控。
　　創(chuàng)傷的愈合依賴于機體對損傷組織的清除,及促進新細胞增殖、遷移至創(chuàng)傷部位,并對新形成的組織結(jié)構(gòu)進行重新排列和組合,以恢復(fù)組織的功能。在這個過程中,細

2、胞外基質(zhì)重塑是至關(guān)重要的。損傷組織的清除與細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的重塑受基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)。MMPs(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一類活性依賴于鋅離子(Zn2+)的內(nèi)源性蛋白水解酶家族,幾乎可降解除多糖外的全部ECM成分。因為MMPs的降解功能,它們可以直接或間接地影響細胞因子及趨化因子活性,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)損傷修復(fù)的的作用?；|(zhì)金屬蛋白酶中的明膠酶,可以降解基膜

3、中的主要成分,如變性的膠原蛋白和IV型膠原蛋白,因此它的作用是不可缺少的。
　　鈣網(wǎng)蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2+結(jié)合分子伴侶,參與多種生理和病理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白一個重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外功能有促進創(chuàng)傷愈合的作用,目前對于CRT促進創(chuàng)傷愈合的機制尚未闡明。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CRT基因敲除能使小鼠胚胎成纖維細胞的MMP2/MMP9表達活性發(fā)生改變,同時出現(xiàn)JNK的活化增強?；谇捌谘芯?我們猜測在創(chuàng)傷修復(fù)的過程中,CRT可能通過

4、JNK信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)MMPs活性的作用。為此,我們通過體外培養(yǎng)細胞模型,探討CRT促進細胞創(chuàng)傷愈合的通路及分子機制,為CRT用于治療慢性遷延不愈的創(chuàng)傷提供更多的理論依據(jù)。
　　目的：
　　體外培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse embryonic fibroblast cells,MEF)野生株(wide type,wt)和鈣網(wǎng)蛋白基因敲除株(calreticulin null,crt),探討CRT對細胞創(chuàng)傷愈合的影響,并

5、進一步了解CRT是否通過JNK信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)MMPs活性的作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)wt及crt-/-小鼠胚胎成纖維細胞,實驗設(shè)對照組、絲裂霉素C(Mitomycin C,MMC)組、MMC+JNK抑制劑組(SP600125),采用細胞劃痕的方法,人為地給wt及crt-/-細胞造成損傷,按0h,8h,12h,24h取樣,拍照,觀察細胞增殖遷徙,創(chuàng)傷愈合情況。同時利用明膠酶譜法從蛋白活性上觀察三組細胞MMP2和MMP9

6、的活性改變。
　　結(jié)果：
　　1.JNK抑制劑對創(chuàng)傷愈合的影響
　　對wt、crt-/-細胞進行劃痕處理,按0h,8h,12h,24h取樣,拍照,觀察到crt-/-細胞的增殖遷徙能力較wt細胞強;予MMC(10umol/L)處理3小時抑制wt、crt-/-細胞的增殖,隨后加入JNK抑制劑(10umol/L),發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑對兩種細胞均有抑制遷徙的能力,而crt-/-細胞的遷徙能力仍較wt細胞的強;
　　2.細胞

7、劃痕對MMP9和MMP2活性的影響
　　給予細胞劃痕處理24小時后,wt細胞、crt-/-細胞的MMP9、MMP2活性均未見明顯改變。
　　3.JNK抑制劑對MMP9和MMP2活性的影響
　　給予JNK抑制劑(10umol/L)處理24小時后,crt-/-細胞的MMP9活性較對照組明顯升高(P<0.001),而MMP2活性較對照組明顯下降(P<0.001);wt細胞的MMP2及MMP9活性較對照組改變不明顯。