1、研究背景和目的：
　　Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶2（Rock2）屬于Rho家族的下游效應蛋白，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用?；|金屬蛋白酶2（MMP2）是主要參與調節(jié)腫瘤細胞侵襲轉移的一種金屬蛋白酶。本研究主要探討原發(fā)性肝癌組織及肝癌細胞中Rock2和MMP2表達及其關聯(lián)情況，并研究Rock2在MMP2介導的肝癌侵襲和轉移中的作用及其具體作用機制。
　　方法：
　　1、采集77例患有原發(fā)性肝細胞癌患者的肝癌組織及癌旁

2、組織，通過運用qRT-PCR、Western Blot等方法檢測肝癌組織及癌旁組織Rock2和MMP2蛋白的表達水平，并通過統(tǒng)計分析兩者的相關性。
　　2、通過熒光定量和Western Blot檢測肝癌細胞HCCLM3、MHCC97H、SMCC7721、HepG2、Huh-7及正常肝細胞HL7702中Rock2和MMP2的mRNA和蛋白表達情況。我們構建了4個shRock2干擾質粒，并將我們構建的4個干擾質粒轉染至肝癌細胞，利用熒

3、光定量PCR和Western Blot檢測轉染48h后Rock2蛋白和mRNA的表達變化；將篩選出的最佳shRock2干擾質粒和Rock2特異性抑制劑(Y27632)轉染到人肝細胞癌HepG2和HCCLM3中，通過運用熒光定量PCR和Western Blot檢測轉染48h后細胞中Rock2、MMP2 mRNA和蛋白表達變化；并且運用transwell實驗和劃痕實驗觀察干擾Rock2和加入Rock2特異性抑制劑(Y27632)處理后肝癌細

4、胞侵襲遷移能力的變化；利用穩(wěn)定轉染肝癌細胞株建立人肝癌裸鼠皮下瘤模型，觀察荷瘤裸鼠腫瘤內(nèi)Rock2和MMP2蛋白表達情況及荷瘤裸鼠出現(xiàn)肝內(nèi)轉移、遠處肺轉移情況；
　　3、通過Western Blot、免疫共沉淀、激光共聚焦確定MMP2和Ub的相互作用及Rock2通過調節(jié)MMP2的泛素化及其降解促進原發(fā)性肝癌細胞的侵襲轉移的機制研究。
　　結果：
　　1、實時定量PCR結果顯示，在肝癌組織中Rock2和MMP2 mRNA

5、表達顯著高于癌旁組織，Western Blot分析結果表明，77.92％（60／77）的患者肝癌組織中Rock2蛋白表達明顯高于癌旁組織，62.34%（48／77）的患者肝癌組織中MMP2蛋白也明顯高于癌旁組織。而且，通過散點圖分析發(fā)現(xiàn)Rock2和MMP2 mRNA和蛋白表達水平呈顯著正相關。另外，通過Western Blot和RT-PCR檢測正常肝細胞HL-7702和五株不同肝癌細胞株中Rock2和MMP2的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)所有肝癌

6、細胞株中Rock2和MMP2的mRNA和蛋白表達均明顯比正常的肝細胞升高，且其表達趨勢較一致。
　　2、穩(wěn)定轉染Rock2最佳干擾shRNA至HepG2和HCCLM3肝癌細胞系，發(fā)現(xiàn)Rock2蛋白的表達明顯下降（p<0.05），同時發(fā)現(xiàn)MMP2基因蛋白表達也隨之下降（p<0.05）；Transwell實驗及劃痕實驗結果顯示降低Rock2表達后，HepG2和HCCLM3細胞侵襲遷移能力明顯減弱（P<0.05），過表達MMP2則可以反

7、轉干擾Rock2導致的侵襲遷移能力下降；利用人肝癌裸鼠皮下腫瘤模型發(fā)現(xiàn)干擾Rock2蛋白表達能減少裸鼠體內(nèi)肝癌細胞的肝內(nèi)轉移及遠處肺轉移（p<0.05）。3、通過免疫共沉淀和激光共聚焦等實驗證實MMP2是通過泛素化降解。同時，證實Rock2通過調節(jié)MMP2的泛素化及其降解穩(wěn)定MMP2的表達來影響肝癌的侵襲和轉移。
　　結論：
　　Rock2能促進肝癌侵襲轉移，其機制是通過干擾MMP2的泛素化降解。為MMP2的控制確定了一種新