1、T細(xì)胞在魚(yú)類(lèi)細(xì)胞免疫及抗感染過(guò)程中起著重要作用,CD3分子是僅存在于T淋巴細(xì)胞的一種膜表面抗原,與T細(xì)胞抗原受體(TCR)相連,參與T淋巴細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),可用于標(biāo)記T淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞等。根據(jù)抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性,通過(guò)制備CD3分子抗體,則可用其對(duì)魚(yú)體組織中T淋巴細(xì)胞進(jìn)行研究。
　　論文根據(jù)已公布的牙鲆CD3ε基因序列重組表達(dá)了牙鲆CD3,并制備了可特異性識(shí)別T細(xì)胞的抗CD3多克隆抗體(多抗),利用該多抗研究了牙鲆T細(xì)胞的

2、組織分布及注射滅活?lèi)?ài)德華氏菌后的數(shù)量變化。本文為深入研究T細(xì)胞在魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)中的作用,理解魚(yú)類(lèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　本文根據(jù)牙鲆CD3ε基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化獲得了CD3ε基因;將CD3基因片段與表達(dá)載體pET-30a質(zhì)粒連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析表明,表達(dá)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為27kDa(包含7kDa的標(biāo)簽蛋白),質(zhì)譜鑒

3、定確認(rèn)為牙鲆CD3蛋白。親和層析法純化重組表達(dá)蛋白,用其免疫Balb/c小鼠制備鼠抗CD3多克隆抗體。
　　利用該多抗與牙鲆白細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀,發(fā)現(xiàn)它可以特異性識(shí)別一個(gè)20kDa的蛋白,質(zhì)譜分析鑒定為牙鲆CD3。利用抗CD3多抗和抗IgM單克隆抗體對(duì)牙鲆白細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光共染色,發(fā)現(xiàn)了CD3+/IgM-、CD3-/IgM+和CD3-/IgM-三種白細(xì)胞,且CD3+白細(xì)胞與IgM+白細(xì)胞無(wú)交叉,表明抗牙鲆CD3多抗能夠特異性識(shí)

4、別T淋巴細(xì)胞,與抗IgM單克隆抗體標(biāo)記的B淋巴細(xì)胞無(wú)交叉反應(yīng)。
　　利用抗CD3多抗對(duì)牙鲆外周血白細(xì)胞、鰓、表皮、胃、腸、脾、頭腎、體腎、肝臟、心臟及性腺進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果顯示在牙鲆的外周血白細(xì)胞、鰓上皮、表皮、胃黏膜固有層及胃腺、腸上皮、脾表面漿膜及白髓中、頭腎表面結(jié)締組織被膜及頭腎組織內(nèi)、體腎的腎小管上皮、肝臟及心臟中觀察到紅色陽(yáng)性信號(hào),而在性腺及陰性對(duì)照中未觀察到陽(yáng)性信號(hào)。利用抗CD3多抗為探針,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定注射滅