1、深綠卷柏(Selaginelladoederleinii)為蕨類植物門卷柏科藥用植物，在我國境內(nèi)分布廣泛，資源豐富。深綠卷柏具有消炎解毒，驅(qū)風(fēng)消腫，抗癌止血等功效，民間有用其治療腫瘤的報(bào)道。目前對深綠卷柏的研究仍不夠系統(tǒng)和深入，本文通過初步篩選發(fā)現(xiàn)深綠卷柏乙酸乙酯部位抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于其它部位，因此本課題主要針對乙酸乙酯部位，深入研究其抗腫瘤作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。目的：對深綠卷柏乙酸乙酯部位體內(nèi)外抗腫瘤活性及其可能的分子作用機(jī)制進(jìn)行研

2、究。
　　方法：采用HPLC圖譜對深綠卷柏乙酸乙酯部位的主要成分進(jìn)行分析；以DU145，HepG2，HeLa，A549，PC12，Vero細(xì)胞為受試細(xì)胞株，采用MTT法檢測深綠卷柏乙酸乙酯部位提取物體外抗腫瘤活性；倒置顯微鏡觀察藥物作用前后HepG2，DU145，MCF-7以及PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；以深綠卷柏乙酸乙酯部位提取物為實(shí)驗(yàn)對象，以 HepG2為受試細(xì)胞株，流式細(xì)胞術(shù)檢測深綠卷柏乙酸乙酯部位提取物誘導(dǎo) HepG2細(xì)胞凋

3、亡的凋亡率；通過 RT-PCR法檢測藥物作用前后細(xì)胞 cox-2、5-lox、flap、12-lox、bcl-2、bax、caspase-3、survivin基因 mRNA表達(dá)水平，從基因水平探討其作用機(jī)制；以接種 H22肝腹水瘤的昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，研究深綠卷柏提取物的體內(nèi)抑瘤作用。采用Autodock4.2軟件對深綠卷柏乙酸乙酯部位6個(gè)主要雙黃酮類成分與 cox-2、5-lox、12-lox、15-lox進(jìn)行分子對接，以驗(yàn)證RT-P

4、CR結(jié)果。
　　結(jié)果：(1)通過 HPLC色譜分析結(jié)合文獻(xiàn)的色譜位移值分析得到深綠卷柏乙酸乙酯部位主要成分為穗花杉雙黃酮、羅波斯塔黃酮、2′′,3′′-二氫-3′,3′′′-雙芹菜素、3',3'''-雙柚皮素、橡膠樹雙黃酮、7,4′,7",4"'-四-0-甲基-穗花杉雙黃酮。(2)MTT法結(jié)果表明，深綠卷柏乙酸乙酯提取物能抑制癌細(xì)胞增長，抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性，對正常細(xì)胞和PC12細(xì)胞細(xì)胞毒作用較小。(3)形態(tài)學(xué)變化:倒置顯微鏡觀察

5、深綠卷柏乙酸乙酯部位提取物作用于 HepG2，DU145，MCF-7細(xì)胞后引起細(xì)胞表面皺縮，體積變小，細(xì)胞膜完整性喪失，細(xì)胞之間間隙變大密度變小，細(xì)胞大量死亡等細(xì)胞凋亡特征；深綠卷柏乙酸乙酯部位對于PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒作用比陽性藥5-氟尿嘧啶明顯要小，且對于癌細(xì)胞比正常細(xì)胞更敏感。(4)流式雙染法結(jié)果表明隨著深綠卷柏乙酸乙酯提取物能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡且隨著其濃度增高，細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢。(5)熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著深綠卷

6、柏乙酸乙酯部位提取物作用時(shí)間的延長，HepG2細(xì)胞內(nèi)5-lox、cox-2、flap、12-lox基因 mRNA表達(dá)量降低，bcl-2、survivin基因 mRNA表達(dá)量降低，同時(shí) bax、caspase-3基因 mRNA表達(dá)量增加。(6)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：深綠卷柏提取物低中高劑量組抑制 H22肝腹水瘤老鼠腫瘤生長的抑瘤率分別為23.3％、39.8%、57.7%，與陽性藥相比深綠卷柏提取物對荷瘤小鼠毒副作用較小。(7)計(jì)算機(jī)模擬分子對接結(jié)

7、果顯示穗花杉雙黃酮、2′′,3′′-二氫-3′,3′′′-雙芹菜素、3',3'''-雙柚皮素與 cox-2、5-lox和12-lox親和力較強(qiáng)。
　　結(jié)論：深綠卷柏乙酸乙酯提取物在體內(nèi)外均具有抗腫瘤作用，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明深綠卷柏在體外具有廣譜的抗腫瘤活性、能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與深綠卷柏乙酸乙酯提取物能影響與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的炎癥因子cox-2、5-lox、flap、12-lox以及凋亡相關(guān)基因bcl-2、