1、目的:Twist基因是存在于人、果蠅、鼠等生物體內(nèi)的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basichelix loop helix,bHLH)蛋白,作為一種轉(zhuǎn)錄因子,主要表達(dá)于胚胎胎盤(pán)、中胚層及成人的某些中胚層來(lái)源的未分化組織。Twist表達(dá)的蛋白在人有202個(gè)氨基酸、小鼠有206個(gè)氨基酸、蟾蜍有166個(gè)氨基酸序列構(gòu)成,其中人類(lèi)和小鼠的氨基酸序列具有96％的同源性,在不同的種屬中其DNA結(jié)合區(qū)域有著100％的序列保守,所有Twist基因都能結(jié)合E-bo

2、x的DNA序列:CANNTG。Twist基因在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控多種基因的表達(dá)[1],最初是在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)它的生物學(xué)功能,它可以通過(guò)促進(jìn)上皮.間葉變(epithelial mesenchymal transition,EMT)來(lái)調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育。近期研究結(jié)果證實(shí)[2,3]Twist具有癌基因的特性,能夠編碼凋亡抑制蛋白,通過(guò)多個(gè)信號(hào)系統(tǒng)參與腫瘤的發(fā)生:抑制分化,通過(guò)降低P53上游的調(diào)控因子ARF的表達(dá)阻斷P53信號(hào)通路,阻礙N-myc信

3、號(hào)系統(tǒng)的傳遞,和抑制NF-κΒ通路等。它還參與了多種上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT并促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,同時(shí)Twsit基因在腫瘤進(jìn)展中可以誘導(dǎo)一系列間充質(zhì)標(biāo)志物的產(chǎn)生。研究表明,Twist基因高表達(dá)于多種實(shí)體瘤中(包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤以及骨肉瘤),并能夠促進(jìn)人乳腺癌和黑色素瘤細(xì)胞系的凋亡。之前我們已經(jīng)有研究證實(shí)Twist基因在結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中呈高表達(dá),而在SW480細(xì)胞株中呈低表達(dá),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將高表達(dá)Twist基因的質(zhì)

4、粒轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株中,觀(guān)察Twist基因?qū)?xì)胞增殖及侵襲性的影響。
　　 方法:
　　 本研究將高表達(dá)Twig基因的質(zhì)粒和陰性對(duì)照的空載質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入SW480細(xì)胞株中,通過(guò)G418篩選后,分別命名為轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組,經(jīng)過(guò)RT-PCR和Western-blot方法的鑒定,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Twist基因的SW480細(xì)胞,再通過(guò)MTT法繪制轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn),然后通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transw

5、ell侵襲實(shí)驗(yàn),觀(guān)察Twist基因?qū)?xì)胞遷移能力和侵襲力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1：RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Twist基因的SW480細(xì)胞中TwistmRNA和Twist蛋白表達(dá)量均顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。
　　 2：通過(guò)MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn),結(jié)果顯示,從第4天開(kāi)始,轉(zhuǎn)染Twist基因的SW480細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　

6、 3：通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,劃痕24小時(shí)后轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移了(40.06±5.56),而對(duì)照組細(xì)胞遷移了(25.24±2.65),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。48小時(shí)后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移了(75.77±8.06),而對(duì)照組遷移了(35.37±6.79),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4：體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Twist基因的SW480細(xì)胞發(fā)生侵襲的個(gè)數(shù)為(154±12),未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)為(73±14),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

7、P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1：通過(guò)本實(shí)驗(yàn)Twist基因成功轉(zhuǎn)入SW480細(xì)胞株并且呈穩(wěn)定表達(dá)。
　　 2：上調(diào)Twist基因表達(dá)后,SW480細(xì)胞體外增殖率明顯上升,說(shuō)明Twist基因能夠增強(qiáng)SW480細(xì)胞的體外增殖能力。
　　 3：上調(diào)Twist基因表達(dá)后,SW480細(xì)胞體外遷移能力明顯增強(qiáng),說(shuō)明Twist基因能夠增強(qiáng)SW480細(xì)胞的遷移能力。
　　 4：上調(diào)Twist基因表達(dá)后,S