1、研究背景:乳腺癌是女性最高發(fā)的惡性腫瘤之一，全球每年約新增138萬名乳腺癌患者，占女性新發(fā)腫瘤的30％。并且近年來的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)病有年輕化的趨勢。并已成為威脅女性生命的“頭號殺手”。乳腺癌是一種全身性疾病，早期手術是最主要的治療方法，而化療和放療是晚期患者治療的重要策略。腫瘤細胞的化療耐藥或放療抵抗是乳腺癌臨床治療的主要障礙，而腫瘤的復發(fā)和轉移是導致乳腺癌患者治療失敗和引起癌癥病人生活質量下降及死亡的主要原因。目前研究認為，腫瘤

2、干細胞是腫瘤不斷生長及復發(fā)轉移的根源，腫瘤微環(huán)境在調控腫瘤干細胞的自我更新、多向分化及耐藥等過程中發(fā)揮重要作用。深入研究腫瘤微環(huán)境中的信號分子及其傳導通路對腫瘤干細胞的調控機制，可為制定新的治療策略有效靶向腫瘤干細胞，減少腫瘤復發(fā)轉移提供理論依據。近年來，一種促炎細胞因子，CXC趨化因子8(CXCL8，又名白細胞介素8，interleukin8，IL-8)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用引起了研究者的高度關注。
　　目的:了解乳腺癌干細

3、胞IL-8及其受體特別是IL-8受體1(CXCR1)的表達情況;進一步探索外源性高表達IL-8對乳腺癌干細胞的影響及其作用機制，為乳腺癌的防治提供實驗依據。
　　方法:首先，利用磁珠分選出乳腺癌MCF-7細胞中CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩組細胞，實時定量PCR、ELISA或WesternBlot法檢測IL-8及其受體CXCR1的表達情況。然后，利用分子克隆技術構建高表達IL-8的真核表達載體（pcDNA3.1

4、/myc-HisC-IL-8重組質粒）;利用脂質體法將重組質粒瞬轉到MCF-7細胞，轉染后24h收集細胞及其培養(yǎng)上清，qRT-PCR和ELISA方法檢測IL-8在MCF-7細胞中的過表達，WesternBlot檢測IL-8受體CXCR1表達的變化。進一步利用CCK-8實驗、Transwell體外侵襲和遷移實驗了解IL-8高表達對MCF-7細胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響。最后，通過成球實驗了解MCF-7細胞高表達IL-8后乳腺癌細胞乳腺

5、球形成能力的變化，流式細胞儀檢測CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩組細胞所占比例的變化WesternBlot檢測乳腺癌干細胞標記物如ALDH1、BMI1表達的變化;同時，將高表達IL-8的MCF-7細胞接種裸鼠，觀察裸鼠腫瘤生長情況;接種后第21天，麻醉后取裸鼠外周血，ELISA法檢測IL-8水平的變化，取荷瘤裸鼠腫瘤組織，WesternBlot檢測腫瘤組織中IL-8受體CXCR1、ALDH1及BMI1表達的變化，免疫組

6、織化學檢測ALDH1表達的變化。
　　結果:
　　1.利用磁珠從乳腺癌MCF-7細胞中分選出CD44+/CD24-和非CD44+/CD24-兩群細胞后，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)CD44+/CD24-細胞分泌的IL-8量明顯高于非CD44+/CD24-細胞，而qRT-PCR結果顯示在mRNA水平上CD44+/CD24-細胞的IL-8的表達低于非CD44+/CD24-細胞。qRT-PCR和WesternBlot檢測證實在mRNA和蛋白

7、水平上CD44+/CD24-細胞IL-8受體CXCR1的表達顯著高于非CD44+/CD24-細胞。
　　2.利用分子克隆技術構建高表達IL-8的真核表達載體(pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重組質粒)，并用脂質體法將重組質粒瞬時轉染到MCF-7細胞中，并用qRT-PCR和ELISA法證實轉染后細胞IL-8mRNA和蛋白表達均升高。進一步通過WesternBlot證實轉染后細胞IL-8受體CXCR1的表達也增加。

8、　　3.pcDNA3.1/myc-HisC-IL-8重組質粒轉染MCF-7細胞后，CCK8法檢測發(fā)現(xiàn)外源性高表達IL-8對乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力沒有明顯影響;在Transwell侵襲實驗中穿過基質膠的MCF-7細胞數分別為:IL-8轉染組:（247.3±17.6）個/高倍鏡視野，無關序列組:（76.7±3.1）個/高倍鏡視野，空白對照組:（86.3±7.4）個/高倍鏡視野;在Transwell遷移實驗中穿過小室基底膜的細胞數分別

9、為:IL-8轉染組:（255.3±22.7）個/高倍鏡視野，無關序列組:（105.3±7.1）個/高倍鏡視野，空白對照組:（126.7±11.6）個/高倍鏡視野，提示，高表達IL-8的乳腺癌MCF-7細胞的遷移和侵襲能力顯著高于轉染無關序列或空白對照的MCF-7細胞，差別具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　4.高表達IL-8的乳腺癌MCF-7細胞形成乳腺球的體積、乳腺球的數量明顯高于空白對照組和無關序列組;流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)高表

10、達IL-8的乳腺癌MCF-7細胞中CD44+/CD24-比例為16.39％±0.56％，明顯高于空白對照組和轉染無關序列組的MCF-7細胞，其CD44+/CD24-的細胞比例分別為6.39％±0.59％，5.28％±1.1％;WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)高表達IL-8的乳腺癌MCF-7細胞乳腺癌干細胞標記物ALDH1及BMI1的表達明顯高于空白對照組和轉染無關序列組細胞，提示高表達IL-8不但可上調乳腺癌MCF-7細胞中的干細胞數量而

11、且還能增強其“干性”標志物。進一步體內研究發(fā)現(xiàn):裸鼠接種等數量的轉染IL-8或轉染無關序列的MCF-7細胞后，轉染IL-8的荷瘤裸鼠腫瘤的生長速度明顯快于轉染無關序列的荷瘤裸鼠。接種后第21天，轉染IL-8的荷瘤裸鼠外周血中IL-8水平顯著高于轉染無關序列的荷瘤裸鼠，同時，轉染IL-8荷瘤裸鼠的瘤重為（4.93±0.3）g，顯著高于轉染無關序列荷瘤裸鼠的瘤重（2.28±0.39）g，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;WesternBl

12、ot檢測證實轉染IL-8后荷瘤裸鼠腫瘤組織中IL-8受體CXCR1的表達顯著高于轉染無關序列的荷瘤裸鼠;免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)轉染IL-8的荷瘤裸鼠腫瘤組織ALDH1的表達明顯高于轉染無關序列的荷瘤裸鼠，且WesternBlot證實轉染IL-8后荷瘤裸鼠腫瘤組織IL-8受體CXCR1及乳腺癌干細胞的相關蛋白ALDH1及BMI1顯著高于轉染無關序列的荷瘤裸鼠。
　　結論:
　　1.乳腺癌CD44+/CD24-干細胞可分泌IL-8