1、目的:1.構(gòu)建支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B cells)和中性粒細(xì)胞(Neutrophils;NEU)混合培養(yǎng)體系。2.探討支氣管上皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞相互作用時(shí),誘導(dǎo)細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)及細(xì)胞因子(IL-6、IL-8)分泌的機(jī)制。
　　方法:1.采用免疫磁珠陽選法分離純化人外周血中性粒細(xì)胞,與支氣管上皮細(xì)胞混合培養(yǎng),構(gòu)建實(shí)驗(yàn)體系。2.實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分成6組:①:單獨(dú)培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞組(BEAS-2B組);②單獨(dú)培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞組(

2、Neutrophils組);③支氣管上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞混合培養(yǎng)組(BEAS-2B+Neutrphils組);④混合培養(yǎng)并加入抑制劑SB203580組(B+N+SB203580組);⑤混合培養(yǎng)并加入抑制劑MG-132組(B+N+MG-132組);⑥混合培養(yǎng)并加入抑制劑SB203580和MG-132組(B+N+SB203580+MG-132組)。3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測BEAS-2B細(xì)胞和NEU細(xì)胞表面粘附分子(ICAM-1、IC

3、AM-3和VCAM-1)的表達(dá);應(yīng)用western blot技術(shù)檢測BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)NF-KB及p38MAPK通路的激活;應(yīng)用Real-time PCR法檢測上述細(xì)胞中ICAM-1、ICAM-3和VCAM-1的基因表達(dá);應(yīng)用Roche Cobas e411和ELISA技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和 IL-8的分泌。
　　結(jié)果:1.用免疫磁珠陽選法可以分離得到純度>98％、活力>98%的中性粒細(xì)胞。2. BEAS-2B細(xì)胞表

4、面粘附分子的表達(dá):BEAS-2B細(xì)胞和NEU細(xì)胞混合培養(yǎng), BEAS-2B細(xì)胞表面粘附分子ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1的表達(dá)較其單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)明顯增高;加入抑制劑后,三種粘附分子的表達(dá)均有明顯減低;ICAM-3、VCAM-1對(duì)兩種抑制劑的敏感程度并無明顯差異,且未發(fā)現(xiàn)兩種抑制劑間的相互作用;MG-132對(duì)ICAM-1的抑制作用明顯強(qiáng)于SB203580,并且兩種抑制劑聯(lián)合使用可進(jìn)一步降低ICAM-1的表達(dá)。3.中性粒細(xì)胞表面粘附分

5、子的表達(dá):BEAS-2B細(xì)胞和NEU細(xì)胞混合培養(yǎng),中性粒細(xì)胞表面ICAM-1的表達(dá)較其單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)明顯增高;加入抑制劑(SB203580、MG-132)表達(dá)量明顯下降。4.與BEAS-2B細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組相比,混合培養(yǎng)組BEAS-2B細(xì)胞ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1的基因表達(dá)水平明顯上調(diào);與單獨(dú)培養(yǎng)NEU細(xì)胞相比,混合培養(yǎng)組ICAM-1的基因表達(dá)水平也明顯上調(diào)。5.western blot結(jié)果顯示BEAS-2B細(xì)胞與NEU細(xì)胞混

6、合培養(yǎng)可以誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞體內(nèi)Phospho-IKB及Phospho-P38MAPK蛋白的表達(dá)。6.BEAS-2B細(xì)胞與NEU細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6的表達(dá)量明顯增加,加入抑制劑(SB203580、 MG-132)均可抑制IL-6的分泌,且MG-132的抑制效果強(qiáng)于SB-203580,同時(shí)兩種抑制劑聯(lián)合使用有協(xié)同作用;.7. BEAS-2B細(xì)胞與NEU細(xì)胞混合培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8的分泌無變化。