1、依賴隨機化末端連結(jié)物PCR(Randomized terminal linker-dependentPCR，RDPCR)[1]是以LMPCR為基礎(chǔ)，改進(jìn)LMPCR的不足并建立起來的，可以定位檢測任何類型DNA損傷的一種分子生物學(xué)方法。該技術(shù)在國家自然科學(xué)基金的資助下，于2002年成功建立。以后應(yīng)用該技術(shù)檢測了多種環(huán)境化學(xué)物和飲用水濃集物引起的p53基因外顯子7DNA損傷，以及對N-ras、H-ras基因外顯子1和2的損傷作用。但LMPC

2、R和改進(jìn)后建立的RDPCR均存在實驗步驟多，必須在多步驟結(jié)束后才能根據(jù)最終的實驗結(jié)果判斷實驗條件的優(yōu)化是否成功，而優(yōu)化的實驗條件對實驗本身的特異性至關(guān)重要。同時由于不同化學(xué)物的損傷性質(zhì)和損傷熱點是不同的，如若能將RDPCR檢測DNA損傷定位于特定基因的核苷酸，則可為致癌物的致癌機理研究提出更為可靠的資料。 本研究的目的是確定一種優(yōu)化RDPCR條件的簡易方法，并定位DNA損傷于核苷酸水平，通過應(yīng)用該法對K-ras基因外顯子1和2D

3、NA損傷的研究，對多種環(huán)境致癌物的檢測，探討這些物質(zhì)的分子致癌機制，為RDPCR的推廣和應(yīng)用積累更多的資料，同時也為環(huán)境致癌物的遺傳毒性研究奠定一定的基礎(chǔ)。本課題分為以下三部分： 第一部分：短片段法優(yōu)化RDPCR實驗條件。常規(guī)培養(yǎng)TK6細(xì)胞，提取基因組DNA，擴(kuò)增目的基因片段，制備K-ras基因外顯子1和2的單鏈探針。擴(kuò)增K-ras基因外顯子1和2的目的產(chǎn)物片段(以下稱短片段)，純化后，用限制性內(nèi)切酶Hinfl酶切、構(gòu)建損傷模型

4、，經(jīng)依賴隨機化末端連接物PCR(RDPCR)擴(kuò)增后與單鏈探針雜交顯色。RDPCR每一步產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果確定每一步的最佳反應(yīng)條件。將該反應(yīng)條件應(yīng)用于酶切基因組DNA，對其酶切位點進(jìn)行檢測，驗證短片段法優(yōu)化RDPCR實驗條件用于檢測基因組DNA損傷的可行性。 結(jié)果：擴(kuò)增的K-ras基因外顯子2測序結(jié)果與GENE BANK中效應(yīng)序列一致，瓊脂糖凝膠電泳及與雙鏈外顯子1和2雜交結(jié)果證實探針制備成功。 Sout

5、hern雜交證實短片段法成功優(yōu)化對K-ras基因外顯子1和2的RDPCR檢測條件。應(yīng)用該實驗條件檢測限制性內(nèi)切酶HinfI酶切構(gòu)建的K-ras基因外顯子1和2DNA．損傷，短片段和基因組DNA均在相對于對照的預(yù)期位置出現(xiàn)雜交條帶。 可見，短片段法優(yōu)化RDPCR實驗條件簡單易行，又節(jié)約人力、物力和時間，適用于對基因組DNA損傷的檢測。 第二部分：RDPCR將DNA損傷定位于核苷酸水平方法的建立。以酶切K-ras基因外顯子2

6、 RDPCR產(chǎn)物為模板，作重復(fù)擴(kuò)增，產(chǎn)物與雜交結(jié)果進(jìn)行比較，純化目的片段，克隆測序，以測序結(jié)果與GENE BANK中K-ras基因外顯子2序列比對，來分析檢測到的損傷位點。通過鑒定損傷位點是否與酶切位點一致，驗證方法的正確性和可行性。測序結(jié)果表明損傷位于酶切位點。證實RDPCR結(jié)合測序技術(shù)，可將DNA損傷位點精確定位于單個核苷酸，有值得繼續(xù)研究和推廣應(yīng)用的價值。 第三部分：RDPCR檢測環(huán)境致癌物的DNA損傷。DCB、Bap、M

7、MS、SA、DCA、TCA、TNF和4NQO染毒TK6細(xì)胞，抽提基因組DNA，以染毒DNA為模板進(jìn)行RDPCR。產(chǎn)物一部分用作Southern blot，一部分用嵌套引物擴(kuò)增后純化回收，克隆、測序。 結(jié)果：RDPCR檢測DCB對K-ras基因外顯子2的DNA損傷中Southern blot在略滯后于對照位置出現(xiàn)雜交條帶；測序結(jié)果顯示損傷位點位于K-ras基因外顯子2第65位G堿基(K-ras基因59位密碼子第二位堿基G)。

8、 RDPCR檢測BaPS<,9><'+/->對K-ras基因外顯子2的DNA損傷中，BaPS<,9><'+>RDPCR產(chǎn)物Southern blot，在略滯后于對照位置出現(xiàn)雜交條帶；測序結(jié)果顯示損傷位點位于K-ras基因外顯子2第66位T堿基(K-ras基因59位密碼子第三號堿基T)；BaPS<,9><'->未檢測到對K-ras基因外顯子2的DNA損傷。 在RDPCR檢測MMS對K-ras基因外顯子2的DNA損傷中，South

9、ernblot在滯后于對照位置出現(xiàn)雜交條帶；測序結(jié)果顯示損傷位點位于K-ras基因外顯子2上游第13位堿基G(K-ras基因外顯子2的上游內(nèi)含子序列)。 在RDPCR檢測SA對K-ras基因外顯子2的DNA損傷中，Southernblot在超前于對照位置出現(xiàn)雜交條帶；測序結(jié)果顯示損傷位點位于K-ras基因外顯子2上第127位堿基T(K-ras基因80位密碼子第三號堿基T)。 在RDPCR檢測DCA對K-ras基因外顯子2

10、的DNA損傷中，Southernblot在次低濃度下出現(xiàn)滯后于對照位置的單一雜交條帶，低濃度下出現(xiàn)超前和滯后對照位置的兩條雜交條帶，滯后條帶位置與次低濃度并不相同；未檢測到TCA對K-ras基因外顯子2的DNA損傷。 在RDPCR檢測TNF和4NQO對K-ras基因外顯子2的DNA損傷中，Southern blot均在略滯后于對照位置出現(xiàn)一條雜交條帶。 由此可見，聯(lián)苯胺等多種環(huán)境化學(xué)物均引起K-ras基因外顯子2的DNA