1、本研究采用兔胚胎作為試驗對象，從中分離克隆出兔類ES細胞，而且系統(tǒng)地比較了不同的培養(yǎng)條件對兔類ES細胞分離培養(yǎng)的影響，并對其進行了傳代培養(yǎng)及鑒定;采用不同濃度的視黃酸(retinoic acid，RA)對分離到的兔類ES細胞向原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)誘導分化效果進行了初步探討，為兔胚胎干細胞的建系及向原始生殖細胞的體外分化研究奠定了基礎。試驗主要結果如下:
　　1.探討超數(shù)排卵對兔胚胎體

2、外發(fā)育能力的影響，收集自然發(fā)情和超數(shù)排卵處理配種后4d的胚胎，接種于MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，以自然發(fā)情交配所得兔囊胚作為對照。結果如下:超數(shù)排卵組的胚胎貼壁率、ICM形成率和F1代形成率高于自然發(fā)情組，但沒有顯著差異(P＞0.05)，兔超數(shù)排卵對兔胚胎的體外發(fā)育能力沒有顯著影響。但在干細胞克隆傳代方面差異顯著(P＜0.05)。因此，為保證試驗的效率，尤其在嚴寒和酷熱的環(huán)境下，兔子自然交配不易成功，對母兔采取超排方式可獲得足夠的胚胎，但在春秋

3、季節(jié)時獲得胚胎以自然發(fā)情交配為好，其胚胎更適宜分離胚胎干細胞。
　　2.探討兔胚胎的不同處理對兔胚胎克隆、傳代的影響。將自然發(fā)情獲得的挑破透明帶胚、離散胚和未處理胚分別置MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。結果顯示:挑破透明帶法和胚胎分割法較對照組得到的胚胎更容易貼壁和增殖，有顯著差異(P＜0.05)，雖然離散胚組的胚胎貼壁率(85.7％)顯著高于挑破透明帶組(70.0％)（P＜0.05），但挑破透明帶組的ICM形成率(53.3％)高于離散胚組(

4、40.0％)(P＜0.05)，挑破透明帶組F1、F2代兔類ES細胞的克隆率分別為34.7％和25.7％，均顯著高于其他兩組（P＜0.05），最高傳至30代。因此，挑破透明帶有利于提高從兔胚胎中分離胚胎干細胞的效率，能更好的支持兔類ES細胞的培養(yǎng)與增殖。
　　3.探討不同培養(yǎng)基對兔胚胎克隆和傳代的影響。結果顯示:胚胎在含15％ FBS的培養(yǎng)液中ICM集落形成率以及1～5代類ES細胞傳代過程中均顯著高于其他兩組含15％ KSR和7.5

5、％FBS+7.5％ KSR的培養(yǎng)液(P＜0.05)，培養(yǎng)液為高糖-DMEM+2mmol/L L-谷氨酰胺+0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇+1％NEAA+15％FBS+100 IU/mL雙抗時改善了兔類ES細胞的體外培養(yǎng)環(huán)境，有利于兔類ES細胞集落的形成，能夠進行穩(wěn)定的傳代。
　　4.探討了機械消化傳代、胰酶消化傳代和“機械+胰酶”消化傳代3種不同的傳代方法對兔類ES細胞分離培養(yǎng)傳代的影響，結果發(fā)現(xiàn)“機械+胰酶”消化傳代法最有利于

6、兔類ES細胞傳代和集落的形成，細胞克隆形態(tài)最佳，為理想的ES細胞分離傳代方法。
　　5.將分離克隆得到的兔類ES細胞進行鑒定，結果顯示，堿性磷酸酶染色和Oct-4、Nanog免疫熒光鑒定兔類ES細胞集落均呈陽性;提取兔類ES細胞集落的RNA，擴增多能性基因Sox2、Nanog和GAPDH經RT-PCR檢測，得到了與預期大小一致的目的片段。體外分化形成具有三個胚層構成的類胚體(embryoid bodies，EBs)。
　　6

7、.探討不同濃度的RA對兔類ES細胞向原始生殖細胞誘導分化的能力。采用不同濃度RA(0.2μM、2μM、20μM)誘導液和不加RA的培養(yǎng)液對兔類ES細胞進行誘導，用流式細胞儀進行DNA倍體分析，結果顯示:0.2μM濃度RA誘導21 d經DNA倍體分析單倍體含量達54.4％，誘導效率最高，2μM濃度RA誘導14d經DNA倍體分析單倍體含量達12.6％，而其他濃度在誘導了相同天數(shù)則不含單倍體，說明兔類ES細胞可以用RA向原始生殖細胞誘導，0.