1、研究背景:
　　血管生成(angiogenesis)在維持卵巢生理功能和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用,提示抗腫瘤血管生成在抗腫瘤治療中具有重要的地位。目前抗VEGF及其受體的藥物在卵巢癌已進入臨床應用,取得了初期的療效,但對高級別的腫瘤單純使用抗VEGF藥物難以控制腫瘤的進展,容易引起耐藥,甚至引發(fā)腫瘤的侵襲和轉移。由于腫瘤的血管生成過程是一個有多種因素參與的,多條信號通路調控的,極其復雜的過程,單獨使用某種血管生成抑制因子或

2、是阻斷與血管生成相關的某一條信號通路并不能完全阻斷血管的生成,因而有必要尋找其他種類的靶基因。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)介導的信號通路是細胞信號傳遞途徑中最常見的一種信號傳遞方式,對機體內各個系統(tǒng)都有著重要的影響。近來研究發(fā)現GPCRs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,因此對 GPCRs通路的調控在腫瘤的病理生理過程具有重要意義。G蛋白信號通路調節(jié)蛋白( Regulator of G P

3、rotein Signaling,RGS)是一類負性調節(jié)G蛋白信號傳導通路的蛋白分子,含有30多種蛋白質。其中RGS5是G蛋白信號通路調節(jié)蛋白家族中的一員,通過促進G蛋白α亞基的GTP酶活性,負性調控GPCRs信號轉導。RGS5高表達于腫瘤新生血管發(fā)育成熟的初期,調節(jié)血管周細胞的分化與募集,參與血管成熟的調控。RGS5在腫瘤血管內皮細胞(Tumor-derived microvascular endothelial cells, TdM

4、ECs)的表達明顯高于正常血管內皮細胞,其基因表達上調會明顯降低新生血管對于抗VEGF所致的血管退行性變的敏感性,表明RGS5可能是重要的替代貝伐珠單抗耐藥性的抗血管生成靶點。
　　研究目的:
　　抗腫瘤血管生成治療的耐藥性源于腫瘤血管的異質性,包括染色體的不穩(wěn)定性,容易產生耐藥株,而了解TdMECs的異質性,尋找特異而有效的靶點,并通過組織來源不同的TdMECs作為藥物靶點的研究,可提高腫瘤抗血管生成藥物療效并降低耐藥性發(fā)

5、生率。RGS5可負性調節(jié)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關的GPCRs信號通路,作為一個最近一兩年漸漸受到關注的蛋白,RGS5的作用和調節(jié)機制還不清楚,它不僅參與血管周細胞的成熟,在腫瘤血管內皮細胞亦有高表達。目前RGS5在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見報道,了解RGS5在卵巢癌的表達特點,研究其在卵巢癌血管生成中的作用及機制,將有利于多靶點抗血管生成的治療策略在卵巢癌的實施和發(fā)展。
　　研究方法:
　　1.回顧性分析87例卵巢癌組織標

6、本,通過連續(xù)切片檢測RGS5在卵巢上皮性腫瘤組織中的表達情況,分析RGS5與臨床各病理參數、患者生存時間以及微血管密度的關系。
　　2.在免疫磁珠細胞分選技術獲得高純度卵巢癌微血管內皮細胞的基礎上,通過對體外培養(yǎng)的卵巢癌微血管內皮細胞(ovarian carcinoma-derived microvascular endothelial cells, ODMECs)形態(tài)、細胞超微結構、體外成管以及生長增值能力的觀察,了解ODMEC

7、s是否在體外培養(yǎng)中的生物學特性,并檢測RGS5的表達情況和特點。
　　3.通過構建RGS5特異性siRNA慢病毒載體下調RGS5蛋白的表達,了解RGS5參與調控的ODMECs體外生物學效應,并進一步探討RGS5在卵巢癌血管生成中的作用及機制。
　　主要結果:
　　1. RGS5不僅在腫瘤血管周細胞表達,在卵巢癌微血管內皮細胞中的表達與Endoglin標記的血管相重疊,但鮮見于CD34標記的成熟血管,在一些無CD34也無

8、Endoglin表達的管腔樣結構中亦偶見RGS5的陽性著色。Endoglin是新生血管的標記物,主要表達于卵巢癌邊緣的微血管,其表達水平與上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer, ECO)血管生成密切相關,提示RGS5可能參與了卵巢癌早期血管生成的調控。
　　2.第一次闡述了RGS5蛋白在卵巢癌細胞有表達,其表達的高低與卵巢癌患者腹膜轉移顯著相關,高表達RGS5的患者腹膜轉移的發(fā)生率明顯低于低表達RGS5

9、的患者,預后亦優(yōu)于后者。此外,RGS5在卵巢癌細胞的表達還與 CD34標記的微血管密度(microvascular densities, MVD)呈負相關。
　　3.與正常內皮細胞多處于靜止期不同,ODMECs增生活躍,胞核遺傳物質豐富,高表達促血管生成因子VEGF、TGF-β的受體VEGFR2和Endoglin,體外成管能力增強。RGS5的表達在ODMECs體外管腔樣結構形成時降低,并且隨細胞培養(yǎng)時間的延長遞減,推測可能與離開腫

10、瘤微環(huán)境有關,然而與 RGS5作用密切相關的 VEGF與PDGF-BB對其在體外的表達無明顯的刺激作用,說明RGS5在腫瘤組織的表達可能不依賴于或不僅僅依賴于VEGFR和PDGF-β信號通路的調節(jié)。
　　4.缺氧可誘導RGS5在ODMECs表達,通過慢病毒載體攜帶的RGS5特異性siRNA,實現對原代培養(yǎng)的ODMECs表達RGS5蛋白的高效抑制后發(fā)現在缺氧條件下RGS5可抑制ODMECs細胞增殖,使細胞周期停滯于G1期到S期的轉化

11、節(jié)點。此外RGS5在ODMECs缺氧時還可誘導細胞的凋亡,但不影響細胞的遷移能力。
　　5.干擾RGS5蛋白的表達可使分裂周期蛋白CDC25A以及與細胞周期密切相關的CDK2蛋白和細胞周期蛋白CyclinE表達增高;MAPK通路中ERK磷酸化明顯降低。ERK1/2抑制劑PD98059可影響CDC25A、CDK2及CyclinE蛋白的表達,其負性調節(jié)上述蛋白的表達與RGS5有協(xié)同效應。進一步研究發(fā)現,用PD98059與LV-siRG

12、S5同時處理ODMECs可明顯降低細胞的增殖率,提示RGS5可負性調節(jié)MAPK/ERK通路介導的CDC25A及下游蛋白CDK2和CyclinE的表達,參與ODMECs細胞周期和細胞增殖的調控。
　　結論:
　　本研究發(fā)現RGS5不僅在卵巢癌血管周細胞、在內皮細胞亦有表達,在癌細胞的表達則與腹膜轉移和患者預后相關,并且與微血管密度呈負相關。缺氧可誘導 RGS5在ODMECs的表達,從而抑制細胞的增殖。因此無論從內皮細胞與血管周