1、目的：胰腺癌以惡性程度高、發(fā)展快、預(yù)后差而聞名，在歐美國(guó)家列惡性腫瘤死亡率的第四位，在我國(guó)該病發(fā)病率及死亡率迅速上升，列惡性腫瘤死亡率的第六位，但其發(fā)病機(jī)制至今未明，治療方面尚無(wú)突破性進(jìn)展。因此，對(duì)胰腺癌分子生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行深入研究非常重要。本文研究 PI3K/Akt的選擇性抑制劑 NVP-BEZ235(BEZ235)體外抑制胰腺癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制，為胰腺癌的生物學(xué)治療提供可能的分子靶點(diǎn)；同時(shí)研究SIX1蛋白表達(dá)在胰腺癌生物學(xué)行為判

2、定中的臨床意義。
　　材料與方法：體外培養(yǎng)胰腺癌 Panc-1細(xì)胞，并用不同濃度 BEZ235刺激Panc-1細(xì)胞。首先應(yīng)用MTT法檢測(cè)BEZ235對(duì)Panc-1細(xì)胞的抑制作用；用倒置顯微鏡觀察 BEZ235對(duì) Panc-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響；用劃痕、transwell等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 BEZ235對(duì) Panc-1細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)的影響；用 Affymetrix GeneChip微陣列分析觀察轉(zhuǎn)移相關(guān)因子Ezrin和SIX1在Panc-1

3、細(xì)胞中BEZ235處理前后異常表達(dá)；利用 Western blotting方法、免疫熒光法檢測(cè) BEZ235處理前后遷移相關(guān)因子 Ezrin蛋白的以及血管生成相關(guān)因子 SIX1蛋白的表達(dá)及 SIX1蛋白定位情況。另外，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了 SIX1蛋白在103例胰腺癌組織以及45例正常胰腺組織中的表達(dá)，并分析了其臨床意義。
　　結(jié)果：
　　1. BEZ235可抑制胰腺癌 Panc-1細(xì)胞中的PI3K/Akt信號(hào)通路。應(yīng)用梯

4、度濃度 BEZ235處理 Panc-1細(xì)胞48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)：與未處理組比較，p-Akt在50 nM處理組開(kāi)始表達(dá)下降，并呈現(xiàn)濃度依賴現(xiàn)象，提示 BEZ235可以抑制Panc-1細(xì)胞中的PI3K/Akt信號(hào)通路。
　　2. BEZ235可抑制Panc-1細(xì)胞增殖。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明BEZ235影響Panc-1細(xì)胞生存能力，在250 nM,500 nM及1000nM BEZ235處理48 h時(shí)抑制明顯。并分別用100 nM,250 n

5、M及500 nM BEZ235處理48 h后，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察給藥前和給藥后 Panc-1細(xì)胞的形態(tài)，給藥前飽滿、緊密的Panc-1細(xì)胞給藥后表現(xiàn)出分散、變形、排列紊亂及死亡，呈 BEZ235濃度依賴性。
　　3. BEZ235可抑制 Panc-1細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與未給藥的對(duì)照組相比，BEZ235藥物處理24 h、48 h、72h后，Panc-1細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：與未

6、給藥的對(duì)照組相比，250 nM BEZ235藥物處理48 h后，Panc-1細(xì)胞的浸潤(rùn)能力明顯受到抑制。Western blotting結(jié)果證明：轉(zhuǎn)移相關(guān)因子 Ezrin和磷酸化 Ezrin(p-Ezrin)的表達(dá)量呈濃度依賴性下降，而且其上游的SIX1蛋白表達(dá)水平也呈明顯地濃度依賴性下降；此外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證實(shí)： BEZ235可抑制 Panc-1細(xì)胞中Ezrin及其上游SIX1蛋白的表達(dá)。
　　4. BEZ235明顯抑制Ezr

7、in和SIX1基因表達(dá)。利用 Affymetrix GeneChip微陣列分析得到的結(jié)果明確，在諸多轉(zhuǎn)移相關(guān)因子中，BEZ235處理前后 Ezrin和 SIX1在 Panc-1細(xì)胞中存在顯著表達(dá)異常，且Ezrin和SIX1表達(dá)量呈濃度依賴性下降。
　　5. SIX1蛋白過(guò)表達(dá)提示胰腺癌患者的不良預(yù)后。免疫組化結(jié)果顯示：與正常胰腺組織相比，SIX1蛋白在胰腺癌組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，且 SIX1蛋白過(guò)表達(dá)與胰腺癌不良預(yù)后明顯相關(guān)，即 S