1、右室流出道重建是矯治許多復(fù)雜先天性紫紺型心臟病的一項(xiàng)重要手段。重建材料先后應(yīng)用了異種(豬)主動(dòng)脈帶瓣管道、同種主/肺動(dòng)脈管道、Contegra管道。異種管道容易鈣化、內(nèi)膜增生；同種管道來源困難，植入宿主體內(nèi)仍有輕度排斥反應(yīng)，在矯治嬰幼兒病變時(shí)大小不易匹配；Contegra管道，仍未擺脫戊二醛處理生物材料的命運(yùn)—鈣化和衰壞，病人最終需要二次手術(shù)更換管道。 牛頸靜脈取材方便，天然的靜脈瓣在低壓系統(tǒng)中抗返流能力強(qiáng)，管徑選擇范圍大(12

2、～22mm)，瓣膜兩端的管壁長(zhǎng)、彈性好，便于縫合操作，是制作帶瓣管道的良好材料。但牛頸靜脈血管壁及瓣膜較薄，應(yīng)用目前成熟的豬主動(dòng)脈瓣去細(xì)胞方法難以達(dá)到既完全去細(xì)胞化，又保持支架結(jié)構(gòu)完整和相應(yīng)強(qiáng)度的目的。目前為止，國內(nèi)外尚未見應(yīng)用去細(xì)胞牛頸靜脈構(gòu)建組織工程帶瓣管道的報(bào)道。 本課題首先研究和探討了合理的牛頸靜脈去細(xì)胞方法；檢測(cè)了該方法處理牛頸靜脈的生物學(xué)性能；取犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞并對(duì)其性能進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)記后種植于去細(xì)胞支架

3、，體外構(gòu)建組織工程右心帶瓣管道；將體外構(gòu)建的帶瓣管道以帶瓣葉補(bǔ)片的形式植入犬肺動(dòng)脈內(nèi)，觀察種植了自體細(xì)胞的去細(xì)胞牛頸靜脈支架在右心血流動(dòng)力環(huán)境下的變化。實(shí)驗(yàn)共分為四部分進(jìn)行。 一、在多次預(yù)備實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定了以胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉(SDS)、和脫氧膽酸鈉為主的三種溶液，即0.1％胰蛋白酶、1mol/LNaCl+0.5％SDS、4％脫氧膽酸鈉+Triton-X-100三種不同的方法對(duì)牛頸靜脈進(jìn)行去細(xì)胞處理。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4

4、％脫氧膽酸鈉+Triton-X-100效果較好。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步細(xì)分了處理程序和處理時(shí)間，觀察更好的去細(xì)胞條件，并對(duì)其生物學(xué)性能進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果①胰蛋白酶法去除細(xì)胞完全，但對(duì)支架損傷大；NaCl+SDS去細(xì)胞不完全；0.01mol/LTris-HCl8h、5％Triton-X-10012h、0.01mol/LTris-HCl3h、4％脫氧膽酸鈉6h、PBS漂洗12h處理，能夠有效去除牛頸靜脈瓣膜及管壁細(xì)胞成分，對(duì)瓣膜及靜脈壁損傷輕微。②H

5、E、苦味酸—天狼猩紅染色、彈力纖維染色、掃描電鏡、透視電鏡檢測(cè)瓣膜及血管壁中內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞去除完全，無細(xì)胞核碎片，且瓣膜及血管壁膠原纖維和彈力纖維波浪狀排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。③去細(xì)胞處理的牛頸靜脈瓣膜、血管壁基因組DNA含量，分別為新鮮瓣膜及血管壁的2.42％、2.75％，表明細(xì)胞去除完全。④去細(xì)胞牛頸靜脈組織厚度(瓣膜0.27±0.07mm，血管壁1.60±0.27mm)與新鮮牛頸靜脈(瓣膜0.23±0.05mm，血管壁1.41±

6、0.22mm)無顯著性差異；去細(xì)胞牛頸靜脈吸水率(瓣膜340.62±12.15％，血管壁332.12±7.56％)與新鮮牛頸靜脈(瓣膜324.25±9.84％，血管壁322.87±10.09％)無顯著性差異；去細(xì)胞牛頸靜脈保水率(瓣膜161.76±7.21％，血管壁157.20±6.32％)與新鮮牛頸靜脈(瓣膜153.12±11.71％，血管壁149.59±9.43％)無顯著性差異；去細(xì)胞牛頸靜脈斷裂強(qiáng)度(軸向瓣膜0.73±0.10mP

7、a/mm2，軸向血管壁1.85±0.48mPa/mm2，橫向血管壁1.20±0.43mPa/mm2)與新鮮牛頸靜脈斷裂強(qiáng)度(軸向瓣膜0.85±0.20mPa/mm2，軸向血管壁2.09±0.58mPa/mm2，橫向血管壁1.49±0.38mPa/mm2)無顯著性差異；去細(xì)胞牛頸靜脈組織延長(zhǎng)率(軸向瓣膜28.94±5.81％，軸向血管壁40.65±8.39％，橫向血管壁37.50±9.11％)與新鮮牛頸靜脈(軸向瓣膜30.54±6.29％

8、，軸向血管壁44.63±12.49％，橫向血管壁38.6±11.27％)無顯著性差異；去細(xì)胞牛頸靜脈熱皺縮溫度(瓣膜64.86±1.36℃，血管壁61.79±1.83℃)與新鮮牛頸靜脈(瓣膜65.13±1.23，血管壁62.36±1.51)無顯著性差異；去細(xì)胞牛頸靜脈可溶性蛋白含量百分比(瓣膜0.204±0.082％，血管壁0.181±0.067％)與新鮮牛頸靜脈(瓣膜0.496±0.124％，血管壁0.389±0.088％)差異顯著；

9、去細(xì)胞牛頸靜脈膠原蛋白含量百分比(瓣膜3.89±0.16％，血管壁4.69±0.28％)與新鮮牛頸靜脈(瓣膜3.92±0.12，血管壁4.72±0.31％)無顯著性差異。⑤皮下包埋顯示去細(xì)胞牛頸靜脈組織相容性好。⑥去細(xì)胞牛頸靜脈血漿蛋白吸附(瓣膜0.137±0.017mg/g，血管壁0.144±0.016mg/g)與新鮮牛頸靜脈(瓣膜0.132±0.012mg/g，血管壁0.139±0.014mg/g)無顯著性差異；去細(xì)胞牛頸靜脈血小板

10、粘附(瓣膜13182±173/mm2，血管壁13193±166/mm2)與新鮮牛頸靜脈(瓣膜13164±181/mm2，血管壁13178±152/mm2)無顯著性差異。以上提示本實(shí)驗(yàn)得到的去細(xì)胞牛頸靜脈支架材料符合組織工程帶瓣管道的要求。 二、用Percoll(1.073g/ml)密度梯度離心分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞并經(jīng)貼壁培養(yǎng)純化得到犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。繪制生長(zhǎng)曲線、通過SH2、Vimentin、α-SMA、CD34、

11、Ⅷ因子、Laminin免疫組化對(duì)其進(jìn)行鑒定，觀察其生物學(xué)特性。結(jié)果：Percoll密度梯度離心分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)貼壁培養(yǎng)后，生長(zhǎng)曲線提示培養(yǎng)3-4d后即進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，5-7d達(dá)高峰。BMSCs傳代后生長(zhǎng)更加迅速，一般3～4d可傳代一次，細(xì)胞形狀穩(wěn)定，10-15d內(nèi)就可獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量(×107)。其細(xì)胞表型為SH2+、Vimentin+、α-SMA+，陽性率分別為95.28±1.73％、64.65±2.04％、76.56±1.

12、25％；CD34-、Ⅷ因子-、Laminin-。提示犬BMSCs具有自然分化為成肌纖維細(xì)胞的表型，生物學(xué)特性表明犬的BMSCs細(xì)胞適于作為構(gòu)建組織工程右心帶瓣管道的種子細(xì)胞。 三、將犬BMSCs培育、應(yīng)用Hoechst33342標(biāo)記并種植在去細(xì)胞牛頸靜脈支架上，體外培育并檢測(cè)培育效果。結(jié)果：BMSCs可被Hoechst33342標(biāo)記，傳代6次后檢測(cè)熒光標(biāo)記可傳入子代細(xì)胞，其熒光亮度無明顯衰減。去細(xì)胞牛頸靜脈支架經(jīng)反復(fù)接種BMSC

13、s后，HE染色和電鏡檢測(cè)證明其表面被種植細(xì)胞覆蓋。說明利用犬BMSCs作為種子細(xì)胞，以去細(xì)胞牛頸靜脈為支架，在體外構(gòu)建組織工程右心帶瓣管道有可行性。 四、取去細(xì)胞牛頸靜脈種植標(biāo)記自體犬BMSCs細(xì)胞，以帶瓣葉補(bǔ)片形式植入6只犬肺動(dòng)脈，于術(shù)后4、8、12周進(jìn)行B超觀察，取出材料觀察其形態(tài)學(xué)和組織學(xué)改變，了解BMSCs細(xì)胞在體內(nèi)分化方向。結(jié)果：B超觀察顯示移植補(bǔ)片隆起于犬肺動(dòng)脈，未見血栓及鈣化，4周可見瓣膜明顯隨血流飄動(dòng)；8周瓣膜信

14、號(hào)較4周減弱；12周瓣膜基本消失。取材后觀察無血栓形成，補(bǔ)片內(nèi)壁光滑，去細(xì)胞瓣膜在犬體內(nèi)有逐漸吸收、變小趨勢(shì)，管壁外形良好無變薄或瘤樣擴(kuò)張。組織學(xué)檢測(cè)支架內(nèi)壁被內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，Hoechst33342標(biāo)記陽性，間質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)入瓣葉及管壁間隙。植入材料鈣含量檢測(cè)：4周鈣含量增加，8周時(shí)鈣含量又有增加，12周時(shí)鈣含量與8周相比無明顯變化。說明去細(xì)胞牛頸靜脈支架種植細(xì)胞后在右心血流環(huán)境中，顯示出有良好的力學(xué)性能、組織相容性和抗降解能力，利用去細(xì)胞牛