1、目的：
　?。?）對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）進(jìn)行體外培養(yǎng)、鑒定。
　?。?）對(duì)D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭(ALF)大鼠給予尾靜脈、門靜脈二種途徑注射同種異體移植大鼠BMSCs，探討B(tài)MSCs移植治療ALF的可能性、對(duì)比兩種移植途徑的療效。
　?。?）通過測定各組血清及肝組織中細(xì)胞因子的表達(dá)，探討B(tài)MSCs移植治療ALF的機(jī)制、了解BMSCs在肝內(nèi)歸巢的影響因素、探討B(tài)MSCs移植對(duì)ALF血清和肝

2、組織中細(xì)胞因子表達(dá)及肝細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，為臨床開展BMSCs移植治療ALF、為臨床提供可靠的ALF預(yù)后評(píng)估系統(tǒng)、實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)ALF的免疫狀態(tài)、病情及預(yù)后并指導(dǎo)臨床治療提供依據(jù)。
　　方法：
　?。?）采用全骨髓貼壁法分離大鼠BMSCs，進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用DAPI標(biāo)記BMSCs、細(xì)胞免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行BMSCs表型鑒定。
　?。?）采用10％D-氨基半乳糖1.4g/kg/次、12小時(shí)一次和0.005%脂多糖2

3、0μg/kg，經(jīng)腹腔注射制備大鼠 ALF模型，觀察造模后大鼠肝功能、肝組織病理損害程度。
　?。?）通過尾靜脈和門靜脈注射的方式移植BMSCs。66只大鼠隨機(jī)平均分為對(duì)照組、尾靜脈移植、門靜脈組。各途徑組同種異體移植 BMSCs，移植BMSCs數(shù)量為1.4×107個(gè)/kg，對(duì)照組給予等體積生理鹽水腹腔注射。于移植后24h、72h、120h、168h收集血液樣本和肝組織標(biāo)本。檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，比較B

4、MSCs移植前后各組肝功能的改善情況。
　　（4）用HE染色觀察肝臟的病理學(xué)變化。用TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡。采用ELISA、RT-PCR方法測定各組血清及肝組織內(nèi)CD163、IL-10的水平。用原位雜交、Western blot方法檢測肝組織基質(zhì)細(xì)胞衍化生長因子-1α（SDF-1α）蛋白的表達(dá)水平；用免疫熒光組織化學(xué)法、RT-PCR方法檢測肝組織血管內(nèi)皮生長因子VEGF蛋白的表達(dá)；采用免疫組化、Western blot方法檢測

5、肝組織Caspase-1、IL-18蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）原代培養(yǎng)的大鼠BMSCs傳代后，高表達(dá)CD29和CD90，不表達(dá)CD11b和CD45。用DAPI進(jìn)行BMSCs標(biāo)記，熒光顯微鏡下觀察可見所有BMSCs均已標(biāo)上藍(lán)色熒光。
　?。?）采用了D-氨基半乳糖模型(D-Gal)/脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠ALF模型。模型建立后，組織HE染色出現(xiàn)典型急性肝損傷表現(xiàn)，肝衰竭對(duì)照組大鼠血清ALT、AST水平和

6、肝細(xì)胞凋亡較BMSCs移植組明顯升高，且有時(shí)間依賴性，這些結(jié)果支持了建模成功。
　?。?）ALF對(duì)照組大鼠血清ALT、AST水平隨病程逐漸升高，在移植后120h、168h，尾靜脈、門靜脈組移植組血清ALT、AST水平與對(duì)照組的差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，尾靜脈與門靜脈移植組之間血清 ALT、AST水平的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　?。?）BMSCs移植后168h，尾靜脈與門靜脈移植組大鼠肝組織均可見大量DA

7、PI陽性標(biāo)記的細(xì)胞，ALF模型對(duì)照組未見DAPI陽性標(biāo)記的細(xì)胞。
　?。?）BMSCs移植后120h、168h，尾靜脈移植組、門靜脈移植組的炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，匯管區(qū)可見膽管增生。尾靜脈組移植組、門靜脈移植組肝組織炎癥改善情況與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。尾靜脈組移植組、門靜脈移植組肝組織炎癥改善情況的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　?。?）在移植后120h、168h，與對(duì)照組相比BM

8、SCs移植組肝細(xì)胞凋亡明顯減輕(P＜0.05)。BMSCs移植后120h尾靜脈組、門靜脈組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為22.00±16.84％、20.60±7.60％；移植后168h細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為18.33±8.78％、12.67±8.78％，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。尾靜脈和門靜脈植組之間肝細(xì)胞凋亡改善情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　?。?）原位雜交、免疫熒光、Western blot結(jié)果顯示：BMSCs移植

9、組中SDF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)水平隨肝功能的好轉(zhuǎn)逐漸逐漸升高，在移植后120h、168h與對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。尾靜脈和門靜脈植組之間肝組織SDF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)肝組織中SDF-1α、VEGF兩者表達(dá)水平呈正相關(guān)(P＜0.05)。肝組織中SDF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)與肝細(xì)胞凋亡之間存在負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別-0.293、-0.274（P＜0.05）。

10、>　?。?）ELISA及RT-PCR結(jié)果顯示：ALF對(duì)照組大鼠血清及肝組織中CDl63、IL-10的水平隨時(shí)間的延長、肝功能的惡化而升高。BMSCs移植組血清及肝組織中CDl63、IL-10的水平隨肝功能的好轉(zhuǎn)逐漸降低，在移植后120h、168h與實(shí)驗(yàn)組相比有顯著差異（P＜0.01）。門靜脈與尾靜脈移植組血清及肝組織中CDl63、IL-10的水平之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血清及肝組織中CDl63、IL-10兩者

11、表達(dá)水平呈正相關(guān)(P＜0.05)。CDl63、IL-10與ALT、AST之間均有明顯的相關(guān)性（P＜0.01）。
　?。?）大鼠肝組織中Caspase-1、IL-18蛋白及蛋白的表達(dá)趨勢一致，BMSCs移植后大鼠肝組織中Caspase-1和IL-18水平明顯下降，在移植后120h、168h，BMSCs移植組中Caspase-1、IL-18蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組相比有顯著差異(P＜0.05)。門靜脈組與尾靜脈移植組之間Caspase-

12、1、IL-18蛋白的表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。尾靜脈和門靜脈植組之間Caspase-1、IL-18蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)Caspase-1、IL-18兩者呈正相關(guān)(P＜0.05)；Caspase-1、IL-18肝細(xì)胞凋亡之間均有明顯的相關(guān)性(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　?。?）采用全骨髓貼壁篩選法可以成功分離培養(yǎng)、擴(kuò)增出高純度大鼠 BMSCs，并保持其原有的生物學(xué)特性。DAPI可

13、成功標(biāo)記 BMSCs。
　?。?）采用10% D-Gal1.4g/kg/次，間隔12小時(shí)，共兩次。聯(lián)合0.005%LPS（10mg/支）20μg/kg、腹腔注射可成功建立大鼠ALF模型。該方法可靠、可重復(fù)性強(qiáng)、模型形成穩(wěn)定、大鼠生存期較長，能滿足本研究的需要。
　?。?）BMSCs尾靜脈、門靜脈移植后，BMSCs可以歸巢到ALF大鼠肝臟。
　?。?）BMSCs移植能夠促進(jìn)ALF大鼠肝功能的恢復(fù)，減輕肝臟組織炎癥壞死程度

14、，BMSCs對(duì)ALF大鼠具有一定治療作用。
　?。?）尾靜脈移植、門靜脈移植途徑均能有效改善ALF大鼠的肝功能、減輕肝臟病理損害程度。但二種途徑相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）BMSCs移植可減少ALF肝臟免疫炎癥反應(yīng)，抑制肝細(xì)胞凋亡。
　?。?）BMSCs可以特異歸巢至損傷肝臟，促進(jìn) VEGF的分泌、并促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及肝臟血管再生、促進(jìn)肝臟組織修復(fù)。
　?。?）CD163、IL-10水平隨肝組織炎癥程度改善而