1、乳酸鏈球菌素Nisin是由部分Lactococcus lactis(乳酸鏈球菌)菌株產生的一種細菌素，可抑制多種革蘭氏陽性細菌，對人體安全無毒，在食品行業(yè)已經應用了50多年，目前尚未見應用中的耐藥菌株報道。隨著Nisin應用的快速增加和普及，Nisin也許也會象抗生素一樣在自然界中產生相應的耐藥性菌株，從而影響和限制Nisin的使用。本研究從浙江杭州自然界及應用Nisin為防腐劑的食品樣品中嘗試分離Nisin的耐藥性菌株，分析在自然界或

2、實際應用環(huán)境中Nisin耐藥菌株產生的原因，并對耐藥菌株的耐藥機理進行探討。 主要研究結果如下： 1.乳酸鏈球菌素耐藥菌株的分離篩選和鑒定。 從杭州十個不同市場采集的土壤、植物葉片及食品樣品中，分離共獲得102個革蘭氏陽性細菌菌株，以不同濃度的Nisin篩選，50 IU Nisin抑制其中47個菌株，占所有菌株的49.0％；100IUNisin抑制61個菌株(59.8％)；200 IU Nisin抑制84個菌株(

3、82.4％)；500IUNisin抑制97個菌株(95.1％)；剩下5個菌株(NIS06、NIS13、NIS17、NIS41、NIS98)為Nisin高度耐藥菌株，500 IU Nisin不能抑制其生長。最小抑菌濃度(MIC)測定發(fā)現(xiàn)NIS41菌株對Nisin的MIC達2560IU，NIS13、NIS17、NIS983個菌株的MIC為1280IU，NIS06菌株的MIC為640IU。通過生理生化方法及16SrDNA序列分析5個細菌均鑒定

4、為葡萄球菌屬，其中NIS41為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，NIS06，NIS13，NIS98為松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)，NIS17為木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。 2.5個Nisin耐藥菌株的耐藥性分析。 分離自自然界及市場樣品的5個Nisin耐藥菌株S.epidermidisNIS41、S.sciuriNIS06、

5、S.sciuriNIS13、SsciuriNIS98、S.xylosusNIS17在無Nisin的培養(yǎng)基中連續(xù)轉接30個世代后，對Nisin的耐藥性沒有發(fā)生顯著改變，說明這5個Nisin耐藥菌株的耐藥性具有較好的遺傳穩(wěn)定性。用堿裂解法提取，5個菌株均沒有發(fā)現(xiàn)質粒；以這5個菌株的基因組DNA為模板，以NisI/NisFEG部分序列為引物的聚合酶鏈式反應法(PCR)未能擴增到NisI/NisFEG疑似基因，說明上述菌株不存在類似乳酸鏈球菌的

6、相關免疫基因。以LB液體培養(yǎng)基、黃色微球菌的去菌液為對照，5個耐藥菌株的培養(yǎng)去菌液37℃分別處理Nisin8h，與對照相比，Nisin活性明顯降低，表明這5個耐藥菌株的去菌液中存在著Nisin失活物質，這可能是其主要的耐藥機制。 3.耐藥菌株S.epidermidis NIS 41 Nisin失活物質(NIS)研究。 Nisin失活物質(NIS)在Nisin耐藥菌株Staphylococcus epidermidis N

7、IS 41的生長穩(wěn)定期開始大量產生。培養(yǎng)液中的NIS在80％飽和度硫酸銨濃度下無法沉淀。37℃、60℃處理20分鐘對NIS活力無明顯影響，80℃以上處理活力下降。NIS在pH4～10內具有活性，最適pH值在8.0左右。NIS4℃下保存8天以內活力基本穩(wěn)定，8天以后活力開始下降，15天左右活力完全喪失。二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、無水乙醚無法從水中萃取NIS，乙醇、丙酮、甲醇無法沉淀NIS。30℃真空條件下NIS可揮發(fā)。NIS對

8、Nisin具有抑制作用，但對地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis ZJU12產生的細菌素無抑制。Tricine-SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)NIS對Nisin具有降解作用，但用NIS處理BSA沒有觀察到降解現(xiàn)象。NIS的初提液經過凍融分管濃縮，高效液相色譜HPLC分離后，電噴霧質譜(ESI-MS)分析得到NIS的分子量174.9。 4.Nisin的商業(yè)產品的純化及對其抑菌作用的影響。 Nisin的商業(yè)產品

9、經過CM-32離子交換色譜，1Kda的透析袋透析脫鹽濃縮，并以Tricine-SDS-PAGE檢測純度，獲得Nisin純品。檢測Nisin粗品和Nisin純品對黃色微球菌M.flavusNCIB8166，表皮葡萄球菌S.epidermidis NIS 41，大腸桿菌Escherichia coli BL21，乳酸鏈球菌Lactococcus lactis LY3的最小抑菌濃度，Nisin粗品和純品對M.flavus NCIB 8166的

10、MIC為50IU；對Nisin耐藥菌株S.epidermidis NIS 41的MIC都是3200IU；25600IU的Nisin純品與Nisin粗品都無法抑制E.coli BL21和L.lactis LY3，說明Nisin純品與Nisin粗品對這四個菌株的抑菌活性沒有顯著差異，純化作用對Nisin的抑菌并沒有影響。平板計數(shù)瓊脂法檢測NaCl對Nisin抑菌作用的影響，發(fā)現(xiàn)OmM，50mM，100mMNaCl濃度條件下，Nisin粗品與