1、目的：脾為后天之本，氣血生化之源，在生命活動(dòng)過(guò)程中占有重要地位。長(zhǎng)期以來(lái)，脾虛證一直是人們研究的熱點(diǎn)。線粒體是糖、氨基酸、脂肪酸最終氧化的場(chǎng)所，并將這些成分在氧化與磷酸化中所釋放的能量?jī)?chǔ)存在ATP中，可以為細(xì)胞的各種生命活動(dòng)提供能量，因此線粒體有細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”之稱。導(dǎo)師在1987年首先提出了“中醫(yī)脾一線粒體”相關(guān)的這一理論，隨著研究的深入，尤其近年來(lái)，中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究的廣泛開(kāi)展，加之分子生物學(xué)的興起，為更深入探討“脾虛”的本質(zhì)奠

2、定了理論基礎(chǔ)。關(guān)于脾虛與自由基的關(guān)系，己有不少研究證明，自由基損傷是脾虛證的病理基礎(chǔ)之一，氧自由基產(chǎn)生可影響線粒體的呼吸功能，繼而使mtDNA受到損傷。本研究以脾虛證模型大鼠組織中線粒體作為研究對(duì)象，運(yùn)用健脾方藥治療脾虛模型大鼠，觀察脾虛大鼠線粒體氧化損傷情況，線粒體膜電位等，從自由基醫(yī)學(xué)角度來(lái)探討脾虛與線粒體的關(guān)系，以及健脾方藥的作用機(jī)制；以脾虛證患者外周血中線粒體作為研究對(duì)象，觀察線粒體DNA損傷情況，從基因與轉(zhuǎn)錄水平闡述脾虛患者線

3、粒體氧利用障礙的影響因素及發(fā)生機(jī)制，進(jìn)一步探討脾虛證與線粒體相關(guān)性的分子生物學(xué)機(jī)制。 方法：研究包括文獻(xiàn)研究和實(shí)驗(yàn)研究。文獻(xiàn)研究中，從古代中醫(yī)對(duì)脾及脾虛的認(rèn)識(shí)、現(xiàn)代中醫(yī)對(duì)脾虛證的認(rèn)識(shí)、線粒體與細(xì)胞的能量轉(zhuǎn)換的現(xiàn)代研究及脾與線粒體相關(guān)性的研究進(jìn)展等方面進(jìn)行了詳細(xì)的整理和總結(jié)。實(shí)驗(yàn)研究由兩部分組成：第一部分選用SPF級(jí)SD大白鼠60只，隨機(jī)分為六組，即正常對(duì)照組、脾虛模型組、四君子湯組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯組、黃芪四君子湯組、當(dāng)歸補(bǔ)血湯合四君

4、子湯組等，每組各10只。以破氣苦降加饑飽失常法制造大鼠脾虛模型，各組大鼠除正常對(duì)照組外每日灌飼小承氣湯煎劑60g/kg體重(20m1/kg體重)，隔日半量進(jìn)食，自由飲水，造模15天結(jié)束。各藥物治療組均造模結(jié)束后給藥30天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察大鼠的一般情況，檢測(cè)大鼠肝、骨骼肌組織線粒體SOD、GSH-Px 活力、MDA 含量及肝、脾組織中膜電位水平。第二部分選擇脾虛證患者40例，濕熱蘊(yùn)脾證患者10例，采用PCR直接測(cè)序法檢測(cè)其外周血白細(xì)胞線粒

5、體DNA ATP6 亞基基因序列突變情況，以及與8例正常人對(duì)照進(jìn)一步檢測(cè)線粒體DNA ATP6 亞基基因mRNA表達(dá)情況。 結(jié)果： 1．脾虛模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的體重減輕，消瘦，糞便時(shí)軟、時(shí)溏，食量減少，游泳耐力下降，倦怠，懶動(dòng)，蜷縮聚堆，瞇眼，弓背等典型脾虛癥狀，但肛溫?zé)o明顯變化，各藥物治療組能減輕造模對(duì)大鼠的影響。 2．脾虛模型組大鼠肝、骨骼肌組織中線粒體SOD、GSH-PX 活力較空白對(duì)照組明顯下降(P<0

6、.01)，各藥物治療組 SOD、GSH-PX 活力較模型組顯著升高(P<0.05或P<0.01)，升高的次序?yàn)椋寒?dāng)歸補(bǔ)血湯合四君子湯組>黃芪四君子湯組>四君子湯組>當(dāng)歸補(bǔ)血湯組。當(dāng)歸補(bǔ)血湯合四君子湯組與黃芪四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，黃芪四君子湯組與四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，四君子湯組與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組之間差異顯著(P<0.05)。 3.脾虛模型組大鼠肝、骨骼肌組織中線粒體MDA含量較空白對(duì)照組顯著升高(P

7、<0.01)，各藥物治療組MDA含量較模型組明顯下降(P<0.05或P<0.01)，降低的次序?yàn)椋寒?dāng)歸補(bǔ)血湯合四君子湯組>黃芪四君子湯組>四君子湯組>當(dāng)歸補(bǔ)血湯組。當(dāng)歸補(bǔ)血湯合四君子湯組與黃芪四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，黃芪四君子湯組與四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，四君子湯組與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組之間差異顯著(P<0.05)。 4.脾虛模型組大鼠肝臟及脾臟組織中線粒體膜電位較空白對(duì)照組明顯下降，差異顯著(P<0.0

8、1)，各藥物治療組均較模型組明顯升高(P<0.05或P<0.01)，升高的次序?yàn)椋寒?dāng)歸補(bǔ)血湯合四君子湯組>黃芪四君子湯組>四君子湯組>當(dāng)歸補(bǔ)血湯組。當(dāng)歸補(bǔ)血湯合四君子湯組與黃芪四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，黃芪四君子湯組與四君子湯組之間差異顯著(P<0.05)，四君子湯組與當(dāng)歸補(bǔ)血湯組之間差異顯著(P<0.05)。 5.經(jīng)統(tǒng)計(jì)脾虛證患者組總突變率為95％，脾胃濕熱證組總突變率為100％。脾氣虛證組總突變率為80％，其中

9、同義突變率為33％，缺失率為20％，插入突變率為13％：氣虛不攝血證組總突變率為100％，其中同義突變率為58％，缺失率為0，插入突變率為17％：脾陰虛證組總突變率為100％，其中同義突變率為0，缺失率為25％，插入突變率為25％；脾陽(yáng)虛證組總突變率為100％，其中同義突變率為11％，缺失率為0，插入突變率為O；脾胃濕熱證組總突變率為100％，其中同義突變率為40％，缺失率為0，插入突變率為0。 ①脾氣虛證組 8550T、859

10、9C 插入突變各1例，引起mRNA 閱讀框架改變，發(fā)生率均為6.7％；A8555T、C8563T、C8575G、A8566G、A8567G點(diǎn)突變各1例，分別使編碼氨基酸由組氨酸變?yōu)榱涟彼?、組氨酸變?yōu)轳槹彼帷⒏彼嶙優(yōu)楸彼?、異亮氨酸變?yōu)榻Y(jié)氨酸、天酰氨酸變?yōu)榻z氨酸，發(fā)生率均為6.7％；A8564、A8566、C8560空缺失突變各1例，引起mRNA 閱讀框架改變，發(fā)生率均為6.7％。 ②氣不攝血證組8570T插入突變2例，引起mR

11、NA 閱讀框架改變，發(fā)生率17％；A8567G 點(diǎn)突變2例、C8552G 點(diǎn)突變1例，分別使編碼氨基酸由天酰氨酸變?yōu)榻z氨酸、丙氨酸變?yōu)楦拾彼幔l(fā)生率分別為17％、8.3％。 ③脾陰虛證組共4例患者，分別為8608C插入突變1例，C8599空缺失突變1例，均引起mRNA閱讀框架改變；C8649A點(diǎn)突變1例，T8602c 點(diǎn)突變1例，使編碼氨基酸由絲氨酸變?yōu)楦彼帷?④脾陽(yáng)虛證組C9196T、C9199T點(diǎn)突變各4例，均使編

12、碼氨基酸由谷酰氨酸變?yōu)榻K止密碼子，發(fā)生率均為44％。 ⑤脾胃濕熱證組C9197T點(diǎn)突變3例、C9200T 點(diǎn)突變1例，均使編碼氨基酸由蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，發(fā)生率分別為30％、10％；G8885A點(diǎn)突變2例，均使編碼氨基酸由精氨酸變?yōu)橘嚢彼?，發(fā)生率為20％。 6.正常人組的熒光生長(zhǎng)曲線呈明顯陽(yáng)性；脾虛證各組和脾胃濕熱證組熒光反應(yīng)均弱于正常人組，差異顯著(P<0.01)；脾氣虛證組的熒光反應(yīng)弱于脾陰虛證組(因病例數(shù)偏少，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)

13、比較)和脾陽(yáng)虛證組(P<0.01)；脾氣虛證組熒光反應(yīng)雖弱于脾胃濕熱證組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；脾陽(yáng)虛證組熒光反應(yīng)弱于脾胃濕熱證組，差異顯著(P<0.01)。 結(jié)論： 1.饑飽失常加苦降破氣法，是目前塑造脾虛動(dòng)物模型較理想的方法之一。 2.脾虛模型大鼠組織線粒體中存在氧化抗氧化失衡，提示脾虛證和線粒體氧化損傷發(fā)生密切相關(guān)。 3.脾虛證大鼠組織的線粒體膜電位比配的降低說(shuō)明脾虛證模型存在線粒體功能的

14、損傷，脾虛證與線粒體膜電位密切相關(guān)。 4.氣血雙補(bǔ)法對(duì)于升高脾虛證大鼠組織中SOD，GSH-Px 活性，降低MDA含量，以及提高線粒體膜電位水平效果優(yōu)于單純補(bǔ)氣健脾法，說(shuō)明補(bǔ)氣健脾方中加入補(bǔ)血養(yǎng)血，活血行血之劑后，能夠明顯增強(qiáng)補(bǔ)氣的作用。 5.脾虛證患者存在mtDNA 堿基點(diǎn)突變、缺失或插入，并造成編碼氨基酸組成以及閱讀框架的改變，導(dǎo)致mtDNA損傷，進(jìn)而基因表達(dá)的下降，使得生成功能異?；驘o(wú)功能的亞基蛋白而直接影響F<,