1、目的：通過觀察腦脊液誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)定向分化為神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells，NPCs)的情況，進(jìn)一步完善腦脊液誘導(dǎo)BMSCs定向分化為NPCs的方法學(xué)。通過觀察損傷脊髓勻漿上清液共培養(yǎng)對腦脊液誘導(dǎo)的骨髓源性神經(jīng)前體細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells-derived neural p

2、recursor cells,BMSC-Ns)增殖、分化的影響，以及分化產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)和產(chǎn)生髓鞘前脂蛋白(myelin proteolipid protein，PLP)的功能，為腦脊液誘導(dǎo)的BMSC-Ns修復(fù)脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)提供依據(jù)。
　　方法：全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，傳至第3

3、代，用免疫組化法檢測細(xì)胞CD34、CD44、CD71的表達(dá)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。取第3代BMSCs，隨機(jī)分為腦脊液誘導(dǎo)組和生長因子誘導(dǎo)組，分別采用100％成人腦脊液、含10μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和10μg/L表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)的DMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)。4d后每組再隨機(jī)分為2組，吸去培養(yǎng)液，分別加入正常

4、大鼠、SCI大鼠的脊髓勻漿上清液共培養(yǎng)21d。在各時(shí)間點(diǎn)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，手持式自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測活細(xì)胞數(shù)量，免疫組化法檢測細(xì)胞巢蛋白(Nestin)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein，GFAP)、微管相關(guān)蛋白-2（microtubule associated protein-2，MAP-2）的表達(dá)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。在各時(shí)間點(diǎn)采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)BDNF和PLP的濃度。

5、
　　結(jié)果：全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs表達(dá)CD44、CD71，不表達(dá)CD34。BMSCs經(jīng)腦脊液、生長因子誘導(dǎo)4d后大部分表達(dá)Nestin，少量表達(dá)GFAP、MAP-2，腦脊液誘導(dǎo)組表達(dá)Nestin、GFAP、MAP-2的陽性細(xì)胞率高于生長因子誘導(dǎo)組表達(dá)Nestin、GFAP、MAP-2的陽性細(xì)胞率(P＜0.05)。誘導(dǎo)后的BMSCs分別與正常脊髓勻漿上清液、損傷脊髓勻漿上清液共培養(yǎng)后，隨著時(shí)間的延長，倒置顯微鏡下觀

6、察到細(xì)胞突起漸漸增多，伸出較長的偽足、相互交織，類似于樹突、軸突樣結(jié)構(gòu)的神經(jīng)細(xì)胞和星狀膠質(zhì)細(xì)胞，21d時(shí)腦脊液誘導(dǎo)的BMSC-Ns僅有少量細(xì)胞脫落、死亡，而生長因子誘導(dǎo)的BMSC-Ns出現(xiàn)大量細(xì)胞脫落、死亡。與損傷脊髓勻漿上清液共培養(yǎng)21d后，腦脊液誘導(dǎo)的BMSC-Ns活細(xì)胞數(shù)量為1.73×105±0.06×105，明顯多于生長因子誘導(dǎo)的BMSC-Ns活細(xì)胞數(shù)量，少于正常脊髓勻漿上清液共培養(yǎng)的BMSC-Ns活細(xì)胞數(shù)量(P＜0.05)。共

7、培養(yǎng)21d后，各組表達(dá)MAP-2的陽性細(xì)胞率明顯高于表達(dá)GFAP的陽性細(xì)胞率(P＜0.05)。腦脊液誘導(dǎo)的BMSC-Ns表達(dá)GFAP、MAP-2的陽性細(xì)胞率均高于生長因子誘導(dǎo)的BMSC-Ns表達(dá)GFAP、MAP-2的陽性細(xì)胞率(P＜0.05)。損傷脊髓勻漿上清液共培養(yǎng)的BMSC-Ns表達(dá)GFAP、MAP-2的陽性細(xì)胞率均高于正常脊髓勻漿上清液共培養(yǎng)的BMSC-Ns表達(dá)GFAP、MAP-2的陽性細(xì)胞率(P＜0.05）。與脊髓勻漿上清液共培

8、養(yǎng)后，隨著時(shí)間的延長，各組細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)BDNF、PLP濃度起初均逐漸下降，6d后逐漸增高。9d后生長因子誘導(dǎo)的BMSC-Ns培養(yǎng)液內(nèi)BDNF、PLP的濃度逐漸下降，腦脊液誘導(dǎo)的BMSC-Ns培養(yǎng)液內(nèi)BDNF、PLP的濃度無下降趨勢。腦脊液誘導(dǎo)的BMSC-Ns培養(yǎng)液內(nèi)BDNF、PLP的濃度在3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d均高于生長因子誘導(dǎo)的BMSC-Ns培養(yǎng)液內(nèi)BDNF、PLP的濃度(P＜0.05)。損傷脊髓勻漿上清液共

9、培養(yǎng)的BMSC-Ns培養(yǎng)液內(nèi)BDNF、PLP水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于正常脊髓勻漿上清液共培養(yǎng)的BMSC-Ns培養(yǎng)液內(nèi)BDNF、PLP的濃度(P＜0.05）。
　　結(jié)論：腦脊液可誘導(dǎo)BMSCs定向分化為NPCs，分化產(chǎn)生的NPCs比例高于細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)法。在損傷脊髓勻漿上清液中腦脊液誘導(dǎo)的BMSC-Ns主要向神經(jīng)元方向分化，分化產(chǎn)生的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量、存活時(shí)間，分化產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞分泌BDNF和產(chǎn)生PLP的能力明顯優(yōu)于細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的