1、膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，90％以上為移行細(xì)胞癌。初次就診的患者中70％～80％為淺表性膀胱癌，其中70％為Ta期，30％為T1期，不論腫瘤分化程度的高低，都未侵及膀胱肌層。經(jīng)尿道切除術(shù)或者膀胱部分切除術(shù)可以切除原發(fā)腫瘤，但由于膀胱癌的多中心性和多發(fā)性特點(diǎn)，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)三分之二，而術(shù)后15年的復(fù)發(fā)率則高達(dá)88％，復(fù)發(fā)的患者中約有15％會(huì)進(jìn)展為浸潤(rùn)性膀胱癌。因此，淺表性膀胱癌手術(shù)后如何預(yù)防復(fù)發(fā)和疾病進(jìn)展是泌尿外科醫(yī)生共同

2、努力的目標(biāo)。自上個(gè)世紀(jì)60年代起開始的膀胱內(nèi)灌注治療有效地延緩或者阻止了腫瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)展，因此，膀胱灌注治療己成為膀胱癌治療的重要手段之一。目前膀胱灌注治療的藥物主要為兩大類，分別為化學(xué)藥物和免疫制劑，其中喜樹堿類衍生物是膀胱灌注化療的重要藥物之一。 喜樹堿類衍生物的構(gòu)效關(guān)系分析表明在7，9，10位被基團(tuán)取代的喜樹堿類衍生物具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。盡管在10位被羥基和烷基取代后，如10-甲氧基喜樹堿有一定的抗腫瘤活性，但是其有較強(qiáng)

3、的毒副作用限制了它的臨床應(yīng)用。相反在9位引入硝基，如9-硝基喜樹堿，不僅能保證其治療效果，同時(shí)還具有較低的毒副作用。但要將喜樹堿硝化得到9-硝基喜樹堿是比較困難的，因?yàn)?2-硝基喜樹堿會(huì)是最主要的產(chǎn)物。而對(duì)10-羥基喜樹堿進(jìn)行硝化則容易得到10-甲氧基-9-硝基喜樹堿(MONCPT)，國(guó)內(nèi)華東師范大學(xué)合成了該化合物。該藥系我國(guó)有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的喜樹堿類抗腫瘤新藥，目前正在進(jìn)行臨床前研究。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，本課題就是考察MONC

4、PT對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制作用并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。 目的： 1、研究MONCPT對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞增殖的抑制作用(在體和離體)； 2、考察MONCPT對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞周期的影響，若有影響則進(jìn)一步探討其作用機(jī)制； 方法： 1)采用MTT法，評(píng)價(jià)MONCPT體外抑制膀胱癌5637細(xì)胞活性； 2)采用裸小鼠皮下移植瘤模型，觀察MONCPT對(duì)荷人膀胱癌5637裸小鼠的實(shí)驗(yàn)治療作用；

5、 3)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度MONCPT和MONCPT在不同作用時(shí)間對(duì)5637細(xì)胞周期的影響； 4)采用Western blotting的方法檢測(cè)MONCPT對(duì)5637細(xì)胞p53，CDK7，p21，AKT，Mat1，Wee1，Cyclin B1，CDK1，Cyclin H，Cdc25C等蛋白表達(dá)水平的影響； 結(jié)果： 1、MONCPT對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株的體外抑制作用： 采用MTT法對(duì)人膀胱癌5637細(xì)胞

6、進(jìn)行體外IC50測(cè)定，結(jié)果表明，MONCPT對(duì)人膀胱癌56372胞作用48小時(shí)有較強(qiáng)的抑制增殖作用，IC50值為1.31±0.16 μM。結(jié)果還顯示，隨濃度的下降，MONCPT在體外對(duì)人膀胱癌5637細(xì)胞的抑制率迅速降低，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。 2、MONCPT對(duì)人膀胱癌5637細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)治療作用： 對(duì)裸小鼠體內(nèi)5637腫瘤的實(shí)驗(yàn)治療作用試驗(yàn)結(jié)果顯示，MONCPT 5、10和20mg/kg組裸小鼠體重?zé)o明顯影響(P>0.

7、05)。與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組比較，Irinotican10 mg/kg和MONCPT 10 mg/kg組移植瘤體積從第5天開始顯著減小(P<0.05-0.01)，而MONCPT 20 mg/kg組植瘤體積從第3天開始顯著減小(P<0.05)，MONCPT 5 mg/kg組植瘤體積從第9天開始顯著減小(P<0.01)。MONCPT 5 mg/kg組在給藥后第3、5、7、9、11、13和15天的相對(duì)腫瘤增殖率(T/C，％)分別為103.2％、

8、84.6％、95.7％、80.2％、62.0％、41.6％和23.8％，從第13天開始相對(duì)腫瘤增殖率小于60％；MONCPT 10 mg/kg組相應(yīng)的相對(duì)腫瘤增殖率分別為95.3％、67.7％、61.4％、34.2％、21.2％、11.1％和6.2％，從給藥后第9天開始相對(duì)腫瘤增殖率小于60％；MONCPT 20 mg/kg組相應(yīng)的相對(duì)腫瘤增殖率分別為73.2％、51.9％、40.3％、20.9％、11.7％、6.9％和3.3％，從給藥

9、后第5天開始相對(duì)腫瘤增殖率小于60％；Irinotican 10.0 mg/kg組相應(yīng)的相對(duì)腫瘤增殖率分別為88.1％、70.4％、50.5％、31.3％、20.8％、13.8％和7.3％，從給藥后第7天開始相對(duì)腫瘤增殖率小于60％。給藥15天后剖殺裸小鼠取瘤塊稱重發(fā)現(xiàn)，MONCPT 5 mg/kg、10 mg/kg和20mg/kg組的人膀胱癌5637移植瘤平均重量分別為0.63±0.12g、0.24±0.06 g和0.06±0.03

10、g，與陰性對(duì)照組的1.83±0.30 g比較均有明顯下降(P<0.01)，三個(gè)劑量組相應(yīng)的腫瘤抑制率分別為64.8％、86.2％和96.5％，腫瘤抑制率均大于40％。Irinotican 10.0 mg/kg組的平均瘤重為0.36±0.09 g，與溶劑對(duì)照組比較也有顯著下降(P<0.01)，抑瘤率為81.1％，大于40％。 3、MONCPT誘導(dǎo)人膀胱癌5637細(xì)胞周期阻滯作用： MONCPT10，1，0.1，0.01μM分別對(duì)人

11、膀胱癌5637細(xì)胞作用24小時(shí)后，DNA分析結(jié)果表明，溶劑對(duì)照組的G2/M期的腫瘤細(xì)胞百分率分別為8.56±2.13％；而MONCPT10，1，0.1，0.01μM處理24小時(shí)后，處于G2/M期腫瘤細(xì)胞百分率分別為19.7±3.6％、46.9±7.3％、76.8±9.2％和18.55±3.5％，0.1μM的MONCPT能達(dá)到最大的腫瘤細(xì)胞周期阻滯作用。用0.1μM的MONCPT處理5637細(xì)胞12h，24h，36h和48h，并設(shè)溶劑對(duì)照

12、，收集各組細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的周期阻滯率。結(jié)果顯示，溶劑對(duì)照組的G2/M期的腫瘤細(xì)胞百分率為11.45±2.3％，隨著MONCPT作用時(shí)間的延長(zhǎng)，G2/M期比率分別為22.4±3.85％(12h)、79.18±7.3％(24h)、50.15±6.25％(36h)和29.7±3.85％(48h)。 4、MONCPT對(duì)5637細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響： 用0.1μM MONCPT分別處理5637細(xì)胞12，24，3

13、6和48h，并設(shè)對(duì)照，收集各組細(xì)胞，提取蛋白，用Western印跡法檢測(cè)CDK1、CyclinB1、Cyclin H、MAT1、AKT、Wee1、CDK7，Cdc25C，p21和p53蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，MONCPT可使人膀胱癌5637細(xì)胞p53，p21的表達(dá)先增加后下降，MAT1、CyclinB1的表達(dá)先下降后增加，CDK1、CDK7、Cdc25C、Cyclin H、AKT、Wee1的表達(dá)量下降。 討

14、論和結(jié)論： MONCPT是新合成的喜樹堿類衍生物。體內(nèi)外的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)MONCPT對(duì)人膀胱癌5637細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制增殖作用，同時(shí)我們還證實(shí)這種作用是可以通過對(duì)細(xì)胞周期G2/M期阻滯實(shí)現(xiàn)的。 近幾年來，植物來源的抗腫瘤藥物受到了廣泛的關(guān)注。當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞遇到DNA損傷時(shí)，細(xì)胞周期會(huì)停滯直到錯(cuò)誤被糾正，細(xì)胞周期G2/M期被阻滯后細(xì)胞將停滯生長(zhǎng)。相比較G1/S，人們對(duì)G2/M了解的并不多，然而這個(gè)周期檢驗(yàn)點(diǎn)對(duì)于腫瘤發(fā)生卻

15、是非常重要的。G2/M的轉(zhuǎn)變是受到Cdc家族蛋白和cyclin調(diào)控的，Cdc2可以被四個(gè)轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)p53，Gadd45，p21和14-3-3 σ所抑制。 p53可作為轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)另外幾種蛋白的產(chǎn)生，如p21，從而達(dá)到調(diào)控細(xì)胞周期的作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，cyclin的結(jié)合和CAK對(duì)Cdc2的Thr161位磷酸化對(duì)于Cdc2-cyclin B復(fù)合物的活性都是非常重要的。若沒有Cdc25C對(duì)Cdc2的Thr14和Tyr15位去磷酸化

16、，且Plk1磷酸化cyclin B時(shí)，細(xì)胞周期將被停滯。 當(dāng)用0.1 μM MONCPT分別處理5637細(xì)胞12，24，36和48h，Western印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，5637細(xì)胞的p53，p21表達(dá)先增加后下降，MAT1、CyclinB1表達(dá)先下降后增加，CDK1、CDK7、Cdc25C、Cyclin H、AKT、Wee1表達(dá)量下降。因此，我們推測(cè)，MONCPT使人膀胱癌5637細(xì)胞終止在G2/M期的作用可能

17、是其通過誘導(dǎo)細(xì)胞p53、p21表達(dá)上調(diào)和CyclinB1、CDK1、CDK7、AKT、Wee1、Cyclin H、Mat1和Cdc25C表達(dá)下調(diào)，從而使細(xì)胞終止在G2/M期，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。綜上所述，我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MONCPT對(duì)人膀胱癌5637細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能與p53通路、CDK7、Cdc25C及cyclin B1-CDK1復(fù)合物有密切關(guān)系，通過阻滯膀胱癌細(xì)胞周期而發(fā)揮抗腫瘤活性。在體和離體實(shí)驗(yàn)證