1、目的：1.合成嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ζ的基因，并建立其真核表達載體；2.用嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ζ基因修飾NK-92細胞；3.建立荷人乳腺癌細胞MDA-MB453（erbB2陽性）、MDA-MB231（erbB2陰性）裸鼠皮下移植瘤模型；4.通過體外及體內(nèi)實驗研究基因修飾的NK-92細胞對erbB21陽性乳腺癌細胞的特異性殺傷。
　　 方法：1.設(shè)計嵌合抗原受體的基因序列，

2、由抗erbB2抗體單鏈可變區(qū)（scFv）、c-myc tag、CD8a（ENST00000283635）、CD28（ENST00000374478）及CD3ζ鏈（ENST00000392122）連接而成，化學(xué)合成長度為50-70bp的單鏈oligo，利用PCR將合成的oligo拼接成完整的序列，將完整的序列經(jīng)HindⅢ和EcoRI酶切后連接至目的載體PCDNA3.1（+）中。2.用Amaxa Nucleofector技術(shù)將嵌合受體ant

3、i-erbB2scFv-CD28-ζ基因轉(zhuǎn)入NK-92細胞。3.RT-PCR法檢測抗原受體mRNAg達；免疫熒光法檢測抗原受體在NK-92細胞表面的表達。4.流式細胞儀檢測NK-92-scFv-erbB2-CD28-ζ和NK-92細胞表面CD27、CD158d、NKG2D和CD85j的表達變化。5.用CCK8法檢測基因修飾的NK-92細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。6.體內(nèi)抗瘤試驗：第1個模型，MDA-MB453細胞或MDA-MB231細胞

4、接種于BALB/C裸鼠背部皮下，同時尾靜脈注射NK-92-scFv-erbB2-CD28-ζ細胞或未轉(zhuǎn)染的NK-92細胞，比較各組成瘤率。第2個模型，MDA-MB453細胞或MDA-MB231細胞接種于BALB/C裸鼠背部皮下建立裸鼠皮下移植瘤模型。荷瘤小鼠隨機分為4組，于第1、8天經(jīng)尾靜脈注射NK-92-scFv-erbB2-CD28-ζ細胞或未轉(zhuǎn)染的NK-92細胞。第2、9天分別取小鼠靜脈血用ELISA方法檢測其中γ-干擾素（IFN

5、-γ）水平。7.實驗動物死后取出皮下移植瘤包塊和肺臟，福爾馬林固定，石蠟包埋，切片常規(guī)H&E染色，免疫組化檢測CD3、NKG2D、CD56、CD16的表達。
　　 結(jié)果：1.成功合成嵌合抗原受體基因并構(gòu)建其真核表達載體PCDNA3.1（+）-anti-erbB2 scFv-CD28-ζ。2.RT-PCR結(jié)果證實了anti-erbB2scFv-CD28-ζmRNA在NK-92細胞中的表達；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果提示NK-92細胞表面嵌

6、合抗原受體anti-erbB2 scFv-CD28-ζ的表達率為18.89％。3.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示兩種NK-92細胞表面CD27、NKG2D、CD158d、CD85j的表達沒有差異。4.anti-erbB2-NK-92細胞對erbB2陽性的MDA-MB453細胞的殺傷率較親本NK-92細胞至少提高了3倍，這種殺傷作用的增強是抗原特異性的，因為兩種NK-92細胞對erbB2陰性的MBA-MD231細胞的殺傷效應(yīng)沒有顯著差異。我們還證實A

7、nti-erbB2-NK-92和親本NK-92細胞對NK細胞敏感的K562細胞的殺傷率同樣很高，說明嵌合受體的表達對NK-92細胞的固有細胞毒活性沒有影響。5.在體內(nèi)抗瘤第1種模型里，接種MDA-MB453細胞的裸鼠注射基因修飾的NK-92細胞后成瘤率（第10天）較注射親本NK-92細胞低，但接種MDA-MB231細胞的裸鼠注射這兩種NK-92細胞的成瘤率沒有明顯差異。在第2種模型里，接受anti-erbB2基因修飾NK-92細胞治療的

8、荷MDA-MB453腫瘤小鼠的血清IFN-γ水平高于接受親本NK-92細胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠。而且，與接受親本NK-92細胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠相比，接受anti-erbB2基因修飾NK-92細胞治療的荷MDA-MB453腫瘤小鼠的腫瘤體積明顯縮小、生存期明顯延長、肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率低、腫瘤組織中有較多淋巴樣細胞浸潤，經(jīng)免疫組化證實是NK-92細胞。
　　 結(jié)論：1.成功合成嵌合受體anti-erbB2

9、scFv-CD28-ζ基因并構(gòu)建其真核表達載體；2.通過Amaxa Nucleofector技術(shù)實現(xiàn)嵌合受體anti-erbB2 scFv-CD28-ζ在NK-92細胞的高表達；3.嵌合受體anti.erbB2 scFv.CD28-ζ在NK-92細胞的表達不影響NK-92細胞的表型特征和固有抗瘤活性；4.在體外，基因修飾的NK-92細胞對erbB2陽性乳腺癌細胞有特異性殺傷；5.在體內(nèi)，基因修飾的NK-92細胞可以特異性抑制erbB2陽