1、目的：
　　下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)(ventrolateral preoptic nucleus,VLPO)與結(jié)節(jié)乳頭體核(tuberomammillary nucleus,TMN)分別是促睡眠中樞和促覺醒調(diào)節(jié)中樞之一。約80％的VLPO神經(jīng)元為γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元和甘丙肽能神經(jīng)元,而TMN是腦中組胺能神經(jīng)元胞體集中聚集的區(qū)域。本實(shí)驗(yàn)采用腦立體定位技術(shù),核團(tuán)內(nèi)微量注射、冰凍切片等方法研究VLPO與TMN之間是否具有雙向調(diào)節(jié)

2、的直接通路。
　　方法：
　　1.模型建立清潔級(jí)成年SD大鼠,雌雄不拘,體重300 g。戊巴比妥鈉(50 mg·kg–1)腹腔注射麻醉后,無(wú)菌手術(shù)操作暴露顱骨,將兩個(gè)不銹鋼引導(dǎo)管(22 gauge)插入VLPO(AP:0.36 mm;R:1.30 mm;H:7.00 mm)和TMN(AP:3.96 mm;R:1.50mm;H:7.70mm)。注射熒光探針后,逐層縫合,送回動(dòng)物室,自由飲水進(jìn)食。術(shù)后將大鼠置于記錄室中休息,待麻

3、醉蘇醒后觀察動(dòng)物行為活動(dòng)。
　　2.動(dòng)物分組將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(TMN+ACSF&VLPO+ACSF組)與實(shí)驗(yàn)組(TMN+ACSF&VLPO+DiO組和TMN+DiO&VLPO+ACSF組)。
　　3.藥物微量注射使用Hamilton微量注射器(針尖直徑26 gauge)通過(guò)引導(dǎo)管向目的核團(tuán)注射ACSF(對(duì)照組)或含熒光探針Fast DiO(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm;發(fā)射波長(zhǎng),499 nm)(實(shí)驗(yàn)組)3?l,注射速度為1?

4、l·min–1,注射完畢滯針3 min防止藥液溢出。
　　4.組織學(xué)鑒定大鼠術(shù)后72 h后,行戊巴比妥鈉(50 mg·kg–1)腹腔注射麻醉并仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,暴露心臟,從心尖處灌注250 ml生理鹽水以及200 ml4%多聚甲醛。灌注結(jié)束后完整取下腦組織并4%多聚甲醛固定24 h,次日使用30%蔗糖PB溶液脫水至沉底。取各組大鼠的大腦的TMN和VLPO進(jìn)行冰凍切片,片厚20-25m,光學(xué)顯微鏡下觀察引導(dǎo)管位置以及藥物注射位點(diǎn)

5、,僅對(duì)定位準(zhǔn)確的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。熒光顯微下觀察Fast DiO標(biāo)記的熒光效果并拍照。
　　結(jié)果：
　　1.神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(neurological severityscore,NSS)采用雙盲法,在ACSF或熒光探針注入核團(tuán)后2 h和24 h對(duì)各組大鼠進(jìn)行NSS評(píng)分。麻醉良好的動(dòng)物在注射過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生抽搐、呼吸紊亂等異常情況。術(shù)后24 h所有大鼠評(píng)分已基本正常。
　　2.熒光標(biāo)記結(jié)果
　　2.1 T

6、MN+ACSF&VLPO+ACSF組在TMN和VLPO腦區(qū)皆未檢測(cè)到綠色熒光標(biāo)記神經(jīng)元。
　　2.2 TMN+ACSF&VLPO+DiO組 TMN腦區(qū)可見明顯的綠色熒光標(biāo)記神經(jīng)元,熒光均勻存在于細(xì)胞質(zhì)膜中,成像清晰。TMN之外的區(qū)域鮮見綠色熒光標(biāo)記。
　　2.3 TMN+DiO&VLPO+ACSF組 VLPO腦區(qū)可見明顯的綠色熒光神經(jīng)元,熒光均勻存在于細(xì)胞質(zhì)膜中,神經(jīng)元細(xì)胞的熒光對(duì)比度高,容易辨認(rèn),但成像的密度較低。VLPO