1、目的:研究外源性視黃酸(Retinoic acid,RA)對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響,并研究乳鼠心肌細(xì)胞中Fas,Fasl,Casepase-3,Pax-8細(xì)胞調(diào)控因子的表達(dá)水平,分析RA誘導(dǎo)心肌損傷的機(jī)制。
　　方法:1.體外培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞以及明確心肌細(xì)胞干預(yù)的最佳時(shí)間:在無(wú)菌條件下取出Balb/c乳鼠心臟,采用胰酶-差速貼壁法分離并純化獲得乳鼠心肌細(xì)胞,并進(jìn)行原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)。2.RA干預(yù)心肌細(xì)胞后進(jìn)行指標(biāo)的檢測(cè):設(shè)置的空

2、白對(duì)照組為選用含20％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)組分別使用含不同濃度視黃酸的培養(yǎng)基干預(yù)心肌細(xì)胞,在用藥干預(yù)后的0h、12h、24h、48h使用倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)并動(dòng)態(tài)記錄細(xì)胞搏動(dòng)力;用MTT法來(lái)檢測(cè)心肌細(xì)胞的抑制率;流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率;3.RA干預(yù)心肌細(xì)胞后Fas、Fasl、Caspase-3、Pax-8調(diào)控因子檢測(cè):Western blot測(cè)定Fas、Fasl、Caspase-3、Pax-8蛋白的

3、表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)Fas、Fasl mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.成功培養(yǎng)Balb/c乳鼠心肌原代細(xì)胞。培養(yǎng)72h的心肌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,表現(xiàn)為搏動(dòng)力強(qiáng),心肌細(xì)胞增殖逐漸進(jìn)入平臺(tái)期,為最佳的細(xì)胞干預(yù)期。2.視黃酸濃度≥2umol/L時(shí)能顯著抑制正常Balb/c乳鼠心肌細(xì)胞的生長(zhǎng),使細(xì)胞的搏動(dòng)力減弱、凋亡增加,同時(shí)干預(yù)的藥物濃度越高、時(shí)間越長(zhǎng),抑制越明顯。3.與對(duì)照組相比,2umol/L RA組隨作用時(shí)間的延長(zhǎng),Fas、Fa

4、sl、Caspase-3蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05);與之相對(duì)應(yīng)的是Pax-8蛋白的表達(dá)則逐漸降低(P<0.05);Fas、Fasl mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.采用胰酶-差速貼壁法及化學(xué)藥物抑制法能獲取存活率高、純度高的心肌原代細(xì)胞;心肌細(xì)胞培養(yǎng)72h為最佳的心肌細(xì)胞干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。2.高濃度RA能抑制心肌細(xì)胞生長(zhǎng),使細(xì)胞搏動(dòng)力減弱或消失,并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。3. RA通過(guò)調(diào)節(jié)Fas、Fasl、Cas