1、三（2-氯乙基）磷酸酯（tris(2-chloroethyl) phosphate，TCEP）是一種常用的阻燃劑和增塑劑。由于TCEP以非共價鍵的方式結(jié)合在高分子材料中，因而極易逸出進(jìn)入環(huán)境。目前，環(huán)境樣品（室內(nèi)空氣、飲用水和室內(nèi)灰塵等）和生物樣品（斑馬魚、海鷗和人母乳）中已檢出 TCEP。實(shí)驗(yàn)研究表明，TCEP有神經(jīng)毒性、生殖毒性和內(nèi)分泌毒性，并可致小鼠肝臟腫瘤。但是，TCEP致肝毒性作用的機(jī)制仍不清楚。
　　外源性毒物侵入機(jī)體

2、后常誘導(dǎo)過量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的生成，繼而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA、多醣體和脂類等大分子物質(zhì)的損傷。線粒體是內(nèi)源性ROS產(chǎn)生與代謝的主要場所，最先受ROS攻擊，因而影響細(xì)胞的正常分裂和生長，導(dǎo)致細(xì)胞的正常生理功能發(fā)生紊亂。在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的多條信號通路中，PI3K/Akt/mTOR通路是重要的信號通路之一。PI3K被ROS激活后可使膜磷酸肌醇發(fā)生磷酸化，繼而與Akt的PH區(qū)結(jié)合促發(fā)Akt磷酸化,促

3、發(fā)Akt下游分子事件來調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂與生長。
　　不可逆的細(xì)胞生長阻滯是細(xì)胞衰老的重要表型。氧化應(yīng)激、線粒體損傷、端粒變短和DNA損傷等經(jīng)p53-p21-Rb信號通路、DNA損傷反應(yīng)信號通路和NFκB信號通路調(diào)控導(dǎo)致細(xì)胞衰老。本文旨在研究 TCEP的肝細(xì)胞毒性、線粒體毒性以及PI3K/Akt/mTOR通路和p53-p21-Rb通路在TCEP致肝細(xì)胞生長阻滯中的調(diào)控機(jī)制，為闡明TCEP致肝毒性的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一

4、部分 TCEP致肝細(xì)胞毒性的研究
　　目的：研究TCEP的肝細(xì)胞毒性。
　　方法：用TCEP（3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L）和DMSO（終濃度<0.1％，溶劑對照）分別處理張氏人肝細(xì)胞、人胚肝細(xì)胞（L02）和人肝腫瘤細(xì)胞（HepG2）24h和48h。檢測細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶釋放率、細(xì)胞色素P4501A1和3A4酶活力、評價細(xì)胞氧化應(yīng)激（包括胞內(nèi)ROS、丙二醛、谷胱甘肽過氧化物

5、酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和還原型胱甘肽/氧化型谷胱甘肽）以及細(xì)胞增殖率、細(xì)胞周期分布和凋亡率。
　　結(jié)果：①TCEP處理三種細(xì)胞株24h和48h，張氏人肝細(xì)胞所有處理組的細(xì)胞活力均下降（P<0.05或P<0.01），但L02細(xì)胞僅有200mg/L TCEP處理組的細(xì)胞活力分別降至81.64%（P<0.05）和75.80%（P<0.01），HepG2細(xì)胞僅在200.00mg/L TCEP處理組細(xì)胞活力降至87.30%（P<0.

6、05）和88.49%（P<0.01）；②TCEP處理張氏肝細(xì)胞24h，所有處理組細(xì)胞LDH釋放率升高（P<0.05），在48h僅200mg/L TCEP的細(xì)胞LDH釋放率為0.48（P<0.05）。TCEP處理L02細(xì)胞24h，所有處理組細(xì)胞LDH釋放率升高（P<0.05或P<0.01），在48h，≥50.00mg/L處理組細(xì)胞LDH釋放率均升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h，所有處理組細(xì)胞LDH釋放率

7、均升高（P<0.05）），在48h，≥12.50mg/L處理組細(xì)胞LDH釋放率升高（P<0.05或P<0.01）；③TCEP處理張氏肝細(xì)胞24h，僅200.00mg/L處理組的胞內(nèi)ROS水平升高（P<0.05）。TCEP處理L02細(xì)胞24h，僅200.00mg/L處理組的胞內(nèi)ROS水平升高（P<0.05），在48h，50.00mg/L和200.00mg/L處理組的胞內(nèi)ROS水平升高（P<0.05）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h，50

8、.00mg/L和200.00mg/L處理組胞內(nèi)ROS水平升高（P<0.05），但在48h，僅200.00mg/L處理組胞內(nèi)ROS水平升高（P<0.05）；④TCEP處理張氏肝細(xì)胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組GSH/GSSG比值均升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理L02細(xì)胞24h，僅200.00mg/L處理組的GSH/GSSG比值升高（P<0.05），但在48h所有處理組GSH/GSSG比值均無顯著性變化。TC

9、EP處理HepG2細(xì)胞24h和48h，所有處理組GSH/GSSG比值均升高（P<0.05或P<0.01）；⑤TCEP處理張氏肝細(xì)胞24h，≥12.50mg/L處理組的細(xì)胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01），不過在48h則所有處理組細(xì)胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h，所有處理組細(xì)胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h，僅200.00m

10、g/L TCEP處理組細(xì)胞增殖受到抑制（P<0.05）；⑥TCEP處理三個細(xì)胞株24和48h,所有處理組均未見細(xì)胞凋亡。但TCEP處理張氏細(xì)胞24h，3.12mg/L和50.00mg/L處理組細(xì)胞周期均阻滯在G2/M期（P<0.05），在48h所有處理組細(xì)胞周期均阻滯在G2/M期（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理L02細(xì)胞24h，3.12mg/L和200.00mg/L處理組細(xì)胞周期阻滯在G2/M期（P<0.05），在48h所有

11、處理組均未見細(xì)胞周期分布變化。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h，除200.00mg/L外，其他處理組細(xì)胞周期均阻滯在G2/M期（P<0.05或P<0.01），在48h僅200.00mg/L處理組細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期（P<0.05）。
　　結(jié)論：TCEP導(dǎo)致了肝細(xì)胞氧化抗氧化失衡，抑制了細(xì)胞生長，但未致細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 TCEP促發(fā)線粒體信號通路致細(xì)胞生長阻滯的調(diào)控機(jī)制
　　目的：研究線粒體、Sirtuin

12、s及PI3K/Akt/mTOR通路在TCEP致肝細(xì)胞生長阻滯的調(diào)控機(jī)制，并揭示SIRT1在TCEP致L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞生長抑制中的調(diào)控機(jī)制。方法：用TCEP（3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L）和DMSO（終濃度<0.1%，溶劑對照）分別處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h和48h，評價細(xì)胞線粒體功能（線粒體內(nèi)ROS水平、線粒體膜電位、線粒體DNA拷貝數(shù)目、細(xì)胞內(nèi)ATP水平和胞內(nèi)游離C

13、a2+水平）、Sirtuins蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。用SIRT1抑制劑EX-527與TCEP共處理細(xì)胞，測定細(xì)胞增殖率和PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：①TCEP分別處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h和48h，兩個細(xì)胞株的所有處理組細(xì)胞生長率均降低（P<0.05或P<0.01）；②TCEP處理L02細(xì)胞24h，≥12.50mg/L處理組胞內(nèi)T-

14、AOC水平均升高（P<0.05或P<0.01），在48h，則≥50.00mg/L處理組胞內(nèi)T-AOC水平升高（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h，≥50.00mg/L處理組的胞內(nèi)T-AOC水平均升高（P<0.05），在48h，≥3.12mg/L處理組胞內(nèi)T-AOC水平均升高（P<0.05或P<0.01）；③TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h，僅在48h發(fā)現(xiàn)50.00mg/L和200.00mg/L TCEP處

15、理組胞內(nèi)mtROS水平升高（P<0.05，P<0.01）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h，≥12.50mg/L TCEP處理組胞內(nèi)mtROS含量均升高（P<0.05，P<0.01）；④TCEP處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h和48h，兩個細(xì)胞株所有處理組的mtDNA數(shù)目均下降（P<0.05或P<0.01）；⑤TCEP處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h和48h，兩個細(xì)胞株都僅在24h可見所有處理組MMP下降（P<0.05或

16、P<0.01）；⑥TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h，僅200.00mg/L處理組胞內(nèi)ATP水平降低（P<0.05）。TCEP處理 HepG2細(xì)胞24h，50.00mg/L和200.00mg/L處理組胞內(nèi) ATP水平降低（P<0.05），但在48h各處理組未見胞內(nèi)ATP水平的變化（P>0.05）；⑦TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h，50.00mg/L和200.00mg/L TCEP處理組胞內(nèi)游離 Ca2+水平均升高（P<0.05，

17、P<0.01）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h，在24h僅200.00mg/L TCEP處理胞內(nèi)游離Ca2+水平升高（P<0.05），但在48h可見50.00mg/L和200.00mg/L TCEP處理組胞內(nèi)游離 Ca2+水平均升高（P<0.01）；⑧TCEP處理 L02和HepG2細(xì)胞24h，>3.12mg/L處理組SIRT1基因mRNA表達(dá)均上調(diào)（P<0.05或P<0.01），在48h所有處理組的SIRT1基因mRNA表達(dá)

18、均上調(diào)（P<0.05或P<0.01）；⑨TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h，所有處理組SIRT2基因mRNA表達(dá)下調(diào)（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h，>3.12mg/L處理組SIRT2基因mRNA表達(dá)下調(diào)（P<0.05或P<0.01）；⑩TCEP處理L02細(xì)胞24h，所有處理組SIRT3基因mRNA表達(dá)均下調(diào)（P<0.05或P<0.01），在48h，>3.12mg/L處理組SIRT3基因mRNA

19、表達(dá)均下調(diào)（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h，所有處理組SIRT3基因mRNA表達(dá)均下調(diào)（P<0.05或P<0.01），在48h，>3.12mg/L處理組SIRT3基因mRNA表達(dá)均下調(diào)（P<0.05或P<0.01）；○11 TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h，所有處理組SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào)，但是SIRT3蛋白表達(dá)均下調(diào)，不過僅在200mg/L TCEP處理組可見SIRT2蛋白表達(dá)下調(diào)。TCEP處理H

20、epG2細(xì)胞24h和48h，所有處理組細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào)，但SIRT3蛋白表達(dá)均下調(diào)，SIRT2蛋白表達(dá)變化不明顯；○12 TCEP處理L02細(xì)胞24h，≥12.5mg/L處理組SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào)（P<0.05或P<0.01），在48h，所有處理組SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào)（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h，所有處理組SIRT1蛋白表達(dá)均上調(diào)（P<0.05或P<0.01）；○13 TC

21、EP處理L02細(xì)胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)均下調(diào)。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h和48h，所有處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)均下調(diào)；○14 TCEP處理L02細(xì)胞24h，≥50.00mg/L處理組的細(xì)胞增殖受抑制（P<0.05或 P<0.01），在48h，≥12.50mg/L處理組細(xì)胞增殖均受抑

22、制（P<0.05或P<0.01）。TCEP與EX-527共處理L02細(xì)胞24h和48h，所有處理組的細(xì)胞增殖均受抑制（P<0.01）。TCEP處理HepG2細(xì)胞24h，≥12.50mg/L處理組細(xì)胞增殖均受抑制（P<0.05或P<0.01），在48h僅200.00mg/L處理組細(xì)胞增殖受抑制（P<0.05）。TCEP與EX-527共處理HepG2細(xì)胞24h，≥12.50mg/L處理組細(xì)胞增殖均受抑制（P<0.05或 P<0.01），在4

23、8h，所有處理組細(xì)胞增殖均受抑制（P<0.05或 P<0.01）；○15 TCEP和EX-527共處理L02細(xì)胞24h和48h，所有處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)均下調(diào)。TCEP和EX-527共處理HepG2細(xì)胞24h和48h，所有處理組mTOR、p-mTOR、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)均下調(diào)。
　　結(jié)論：TCEP致肝細(xì)胞線粒體損傷及線粒體功能紊亂，消弱 SIRT1非依賴性PI3K/A

24、kt/mTOR信號通路，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞生長阻滯。
　　第三部分 TCEP激活p53非依賴p21/Rb通路致細(xì)胞衰老樣生長阻滯的調(diào)控機(jī)制
　　目的：研究TCEP致肝細(xì)胞衰老及其p53-p21-Rb信號通路的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：用RNA干擾技術(shù)沉默L02細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)，建立L02-p53細(xì)胞模型。用TCEP（3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L和200.00mg/L）和DMSO（終濃度<0.1%

25、，溶劑對照）分別處理L02細(xì)胞、L02-p53細(xì)胞和Hep3B（p53缺失細(xì)胞株）細(xì)胞24h和48h，對比性研究衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）陽性細(xì)胞率，IL-6分泌水平，以及p53、MDM2、Rb、p-Rb、Ras、p21、IL6R、p38MAPK、p-p38MAPK、NFkB和p-NFkB蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：①TCEP處理 L02細(xì)胞24h和48h，所有處理組的 SA-β-Gal陽性細(xì)胞率升高（P<0.05或P<

26、0.01）。TCEP處理L02-p53細(xì)胞24h，≥12.50mg/L處理組SA-β-Gal陽性細(xì)胞率均升高（P<0.05或P<0.01），在48h所有處理組 SA-β-Gal陽性細(xì)胞率均升高（P<0.01），陰性對照組與溶劑對照組相比無顯著性差異。TCEP處理Hep3B細(xì)胞24h和48h，所有處理組的SA-β-Gal陽性細(xì)胞率均升高（P<0.05或P<0.01）；②TCEP處理L02細(xì)胞24h，≥12.50mg/L處理組IL-6水平均

27、降低（P<0.05或P<0.01），在48h，≥50.00mg/L處理組IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理L02p53-細(xì)胞24h，≥12.50mg/L處理組的IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01），在48h，≥50.00mg/L處理組IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01）。TCEP處理Hep3B細(xì)胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組IL-6水平均降低（P<0.05或P<0.01）

28、；③TCEP處理L02細(xì)胞24h和48h，所有處理組 MDM2蛋白的表達(dá)均上調(diào)，p53蛋白表達(dá)均下調(diào)；≥50.00mg/L處理組p38MAPK、p-p38MAPK、NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表達(dá)均下調(diào)；所有處理組Rb和p-Rb蛋白表達(dá)上調(diào)；≥12.50 mg/L處理組p21蛋白表達(dá)均上調(diào)。TCEP處理L02-p53細(xì)胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組 p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)均下調(diào)，≥50.00mg

29、/L處理組NFκB、p-NFκB和IL6R蛋白表達(dá)均下調(diào)；所有處理組的Rb、p-Rb和p21蛋白表達(dá)均上調(diào)。TCEP處理 Hep3B細(xì)胞24h和48h，≥12.50mg/L處理組p38MAPK、p-p38MAPK和IL6R蛋白表達(dá)均下調(diào)；所有處理組NFκB和p-NFκB蛋白表達(dá)均下調(diào)，Rb、p-Rb和p21蛋白表達(dá)均上調(diào)。
　　結(jié)論：TCEP誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老樣生長阻滯可能由p53非依賴性p21/Rb信號通路調(diào)控。但未見IL-6/IL