1、卵巢癌是最致命的婦科惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤的3％，位居乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、黑素瘤、非何杰金淋巴瘤和腎臟腫瘤之后。卵巢癌占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的15%。卵巢癌組織類型多種多樣，以漿液性腫瘤為最常見的上皮組織類型。盡管近十年在卵巢癌診斷和治療中取得了很多進展，但卵巢癌仍然是一種高致死性疾病。高死亡率的原因主要是缺乏早發(fā)現(xiàn)、早確診的有效手段和患者對化療產(chǎn)生了耐藥性導致癌癥復發(fā)。
　　脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（A

2、PE1）是參與堿基切除修復（BER）途徑的一個多功能酶，APE1能夠修復由外源性或內(nèi)源性刺激造成的氧化應激的堿基損傷。APE1還可以作為多個轉(zhuǎn)錄因子的還原性促活劑，因此又被稱作氧化還原因子1（Ref-1）。APE1能夠活化激活蛋白1（AP-1）、核因子κB（NF-κB）、缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、p53，對細胞凋亡、炎癥、血管生成和生存等各個方面都有重要作用。APE1/Ref-1通過活化參與不同生理過程的轉(zhuǎn)錄因子來維持細胞的氧化

3、還原的穩(wěn)態(tài)，而且還能夠調(diào)控活性氧和活性氮，與維持氧化還原平衡的物質(zhì)進行交互，如硫氧還蛋白、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等。APE1/Ref-1調(diào)控的生理功能包括BER途徑、轉(zhuǎn)錄因子、能量代謝、細胞骨架物質(zhì)和應激相關(guān)反應等。
　　通過自身的異常調(diào)節(jié)、翻譯后修飾或者序列多態(tài)性等機制，多功能酶APE1與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，特別是不同類型的腫瘤，如卵巢癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌等。腫瘤的定義就是體內(nèi)異常細胞的不受控制的生

4、長，誘發(fā)腫瘤的機制一般是遺傳物質(zhì)的缺失、擴增或突變。APE1不僅能夠作為遺傳學標志，而且還可以成為靶向的分子。腫瘤細胞中APE1通常是過度表達的，APE1能夠促進腫瘤細胞的生存，也促進腫瘤對化療和放療的抵抗。APE1的表達異常已經(jīng)被證實與多種腫瘤相關(guān)，而且內(nèi)切酶活性還與腫瘤分級呈正相關(guān)。通過APE1 siRNA（small interfering RNA）下調(diào)腫瘤細胞的APE1的表達，發(fā)現(xiàn)APE1對腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要作用。下調(diào)APE1能

5、夠增強許多腫瘤對化療藥物的敏感性。
　　本課題組在前期的研究中已經(jīng)證實：①APE1的蛋白水平和亞細胞定位與卵巢癌的發(fā)生、鉑類藥物敏感性和臨床預后相關(guān)；②APE1在卵巢癌敏感株和耐藥株中存在表達差異，耐藥株中的蛋白水平明顯高于敏感株；③上調(diào)APE1能顯著降低卵巢癌細胞對鉑類的敏感性；④APE1的氧化還原功能對卵巢癌鉑類耐藥具有重要作用，并且參與了腫瘤的增殖。
　　盡管對APE1在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展所發(fā)揮的作用的研究已經(jīng)取得了一些

6、成果，但許多問題仍未得到圓滿的解答。APE1雖然參與了卵巢癌的鉑類耐藥，但其具體機制如何？對APE1參與鉑類耐藥的具體機制的研究能夠為卵巢癌的臨床治療提供新的思路。
　　絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細胞內(nèi)的重要的信息傳遞通路，參與了細胞的生長、分化、生存和免疫反應等多個生理過程。哺乳動物的MAPK家族包括：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)、c-Jun氨基端激酶(JNK)和p38通路。研究發(fā)

7、現(xiàn)在腫瘤細胞中MAPK通路常常表現(xiàn)功能失調(diào)。多個研究證實MAPK通路參與了腫瘤發(fā)生、血管生成、化療耐藥等多個過程。那么MAPK通路和APE1是否都參與了卵巢癌的鉑類耐藥呢？MAPK通路和APE1的關(guān)系又是如何呢？
　　根據(jù)前期的研究工作，設(shè)計了下述研究方案：
　　(1)通過流式細胞術(shù)檢測探討順鉑對卵巢癌細胞A2780和A2780/DDP細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影響；

8、　　(2)將A2780細胞和A2780/DDP細胞分別轉(zhuǎn)染APE1 pcDNA3.1和APE1 siRNA片段，觀察APE1表達水平對細胞內(nèi)ROS水平的影響；
　　(3) Western blot檢測順鉑對卵巢癌細胞內(nèi)APE1表達及MAPK通路相關(guān)蛋白的影響；
　　(4) MTT法檢測MAPK各通路抑制劑對順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡的影響；
　　(5)通過N-乙酰半胱氨酸（NAC）和H2O2干預細胞內(nèi)ROS水平，觀察ROS

9、水平對順鉑調(diào)控MAPK通路活性的影響；
　　(6)通過Western blot方法，從蛋白水平檢測改變細胞內(nèi)APE1表達對MAPK通路活性的影響；
　　(7) Hoechst33258染色和流式細胞術(shù)檢測ROS水平、APE1表達對順鉑誘導卵巢癌細胞凋亡的影響；
　　(8) Western blot檢測APE1表達和ROS水平對p38 MAPK通路活性和凋亡通路相關(guān)因子的影響；
　　(9)通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期

10、，觀察順鉑、APE1和p38 MAPK通路對細胞周期的影響。
　　(10)構(gòu)建裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，觀察APE1與MAPK通路抑制劑對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響。
　　通過上述實驗，得到了以下結(jié)果：
　　(1)順鉑作用于卵巢癌細胞后，能夠顯著增加細胞內(nèi)ROS水平，2小時后ROS水平達到峰值，并維持峰值至24h，48h后ROS水平下降；A2780/DDP中ROS水平低于A2780水平。
　　(2)通過轉(zhuǎn)染APE

11、1 pcDNA3.1和APE1 siRNA片段，發(fā)現(xiàn)上調(diào)APE1表達能夠降低順鉑刺激細胞所引起的ROS水平的升高，而下調(diào)APE1表達使細胞內(nèi)ROS水平升高，APE1對細胞內(nèi)ROS水平有調(diào)控作用。
　　(3)通過NAC與H2O2干預細胞內(nèi)ROS水平，證實順鉑通過ROS調(diào)控MAPK通路的活性。NAC能夠抑制順鉑所誘導的卵巢癌細胞的凋亡，而H2O2與順鉑協(xié)同促進了卵巢癌細胞的凋亡。
　　(4)順鉑作用于卵巢癌細胞后，通過ROS激活

12、細胞內(nèi)MAPK通路。
　　(5)MTT法檢測結(jié)果表明p38 MAPK通路抑制劑SB203580能夠減弱細胞對順鉑的敏感性，ERK抑制劑與JNK抑制劑能夠增加細胞對順鉑的敏感性。
　　(6)通過改變卵巢癌細胞內(nèi)APE1的表達，并干預細胞內(nèi)ROS水平，發(fā)現(xiàn)APE1可通過調(diào)控ROS水平進而影響p38 MAPK的活性。
　　(7)Hoechst33258染色和流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明NAC能夠抑制順鉑所誘導的卵巢癌細胞的凋亡，而

13、H2O2與順鉑協(xié)同促進了卵巢癌細胞的凋亡，提示順鉑通過ROS影響細胞凋亡。而APE1也通過調(diào)控ROS水平影響順鉑誘導的細胞凋亡。
　　(8)順鉑能夠促進Cyt C的釋放，激活Caspase家族，Caspase-3與Caspase-9剪切體水平上調(diào)。上調(diào)APE1表達能夠通過降低ROS水平抑制p38 MAPK的活性，從而減少了凋亡通路相關(guān)因子的表達。
　　(9)順鉑刺激能夠使卵巢癌細胞發(fā)生G1期阻滯，上調(diào)APE1與抑制p38 M

14、APK的活性能減少G1期比例，細胞增殖指數(shù)增加。
　　(10)成功構(gòu)建裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，在活體中驗證了APE1與p38 MAPK通路對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響。
　　綜上所述，在前期工作的基礎(chǔ)上，通過對A2780和A2780/DDP細胞內(nèi)APE1表達與MAPK通路的相關(guān)性進行了進一步研究，發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞中ROS水平的改變與MAPK通路的活性呈正相關(guān)。順鉑能夠通過ROS影響MAPK的活性。而且利用已構(gòu)建好的APE1

15、pcDNA3.1質(zhì)粒和APE1 siRNA片段改變卵巢癌細胞中APE1的表達水平，發(fā)現(xiàn)APE1的表達對卵巢癌細胞內(nèi)的ROS水平起著調(diào)控作用，而ROS水平又與MAPK通路的活性相關(guān)。進一步說明了ROS、MAPK通路與APE1表達之間的關(guān)系。順鉑敏感細胞株A2780中的p38 MAPK活性較順鉑耐藥細胞株A2780/DDP中的活性增加，而抑制p38 MAPK通路減少了順鉑誘導的細胞凋亡效應，說明p38 MAPK的活性在順鉑耐藥機制中發(fā)揮了重