1、研究背景和意義：
　　 結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著我國(guó)人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，雖然近年來醫(yī)療診治水平有了很大的提高，但其死亡率仍居高不下，僅次于肺癌和肝癌，占我國(guó)惡性腫瘤死亡率第三位，嚴(yán)重危害人民群眾健康。
　　 整合素屬于黏附分子家族，是一類由α、β亞單位以非共價(jià)鍵結(jié)合組成的跨膜糖蛋白受體，介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用，通過細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞增殖

2、、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移。整合素在細(xì)胞遷移中的作用主要是通過其與細(xì)胞外基質(zhì)配體不斷的連接與解離實(shí)現(xiàn)，直接介導(dǎo)細(xì)胞的定向遷移過程。整合素αvβ6是一類只表達(dá)于惡性上皮性腫瘤組織而在正常及良性腫瘤組織不表達(dá)的特殊整合素亞型，在腺上皮來源消化道腫瘤如結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、膽管癌中高表達(dá);鱗狀上皮來源腫瘤如肺癌、口腔鱗狀上皮癌亦可見其表達(dá);且主要表達(dá)于腫瘤侵襲邊緣，與多種腫瘤的惡性行為密切相關(guān)。
　　 我們?cè)谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)，整合素αvβ6的表

3、達(dá)與結(jié)腸癌病理類型、分化程度、TNM分期密切相關(guān)，整合素αvβ6陽(yáng)性表達(dá)患者生存期明顯縮短，可作為結(jié)腸癌獨(dú)立的不良預(yù)后指標(biāo);體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)整合素αvβ6的表達(dá)可以提高結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲能力，并在一定程度上提高結(jié)腸癌細(xì)胞抵御凋亡、對(duì)抗化療藥物的能力;我們發(fā)現(xiàn)在整合素β6亞單位與ERK2之間存在直接連接，并明確了β6胞內(nèi)段與ERK2的結(jié)合位點(diǎn)（746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764，下劃線處表示兩者結(jié)合位點(diǎn)），與整合素β6連

4、接的ERK2分子的磷酸化水平更高，提示這種連接可能在一定程度上使ERK2分子發(fā)生構(gòu)象改變，從而更容易被磷酸化，而且能夠保護(hù)與其β6連接的ERK2分子不容易被細(xì)胞質(zhì)中的磷酸酶去磷酸化而失活;不同細(xì)胞密度培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，隨著結(jié)腸癌細(xì)胞密度增加伴隨有PKC活性增強(qiáng)和細(xì)胞表面αvβ6的表達(dá)增多，
　　 20世紀(jì)70年代末和80年代初，人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)一些真核細(xì)胞的膜蛋白并不是靜止地存在于細(xì)胞膜上，而是在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)中以一種動(dòng)態(tài)流轉(zhuǎn)的形式存在

5、，持續(xù)進(jìn)行一個(gè)內(nèi)吞胞吐的循環(huán)過程，如纖連蛋白受體、LDL受體和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等，并逐步建立完善了這種內(nèi)吞胞吐循環(huán)的檢測(cè)方法。作為一種膜蛋白受體，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)整合素也存在這樣持續(xù)快速的內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程，而且整合素的α鏈能夠決定其是否參與內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程以及循環(huán)的速率，例如α5β1、α6β4和Mac-1等整合素都參與細(xì)胞內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程，但α3β1、α4β1和LFA-1等卻循環(huán)得很慢，或根本不存在內(nèi)吞胞吐循環(huán)。2007年英國(guó)的JohnF.Ma

6、shall教授在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中檢測(cè)證實(shí)了整合素αvβ6的內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程，提示整合素αvβ6在細(xì)胞內(nèi)也是以這種快速循環(huán)的形式存在的。
　　 本課題擬在前期整合素αvβ6系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合近年來整合素內(nèi)吞胞吐循環(huán)的理論及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，研究整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)在調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用，尤其是對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，探討整合素αvβ6-ERK2直接連接在整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)中的連接與解離狀態(tài)及所發(fā)揮的

7、作用等，為進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)整合素αvβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用及存在形式，為今后揭示整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)調(diào)控的分子機(jī)制，并進(jìn)行靶向干預(yù)治療，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分
　　 整合素αvβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞中內(nèi)吞胞吐循環(huán)檢測(cè)方法的建立
　　 目的
　　 摸索建立整合素αvβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞中的內(nèi)吞胞吐循環(huán)檢測(cè)體系。
　　 方法(1)內(nèi)吞實(shí)驗(yàn):將結(jié)腸癌細(xì)胞在4℃下用0.2mg/ml的EZ-L

8、inkSulfo-NHS-SS-Biotin溶液對(duì)膜蛋白進(jìn)行生物素標(biāo)記;標(biāo)記后的細(xì)胞加入含10％FBS的培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng);一定時(shí)間（5、10、15、30、60min等）后，倒出培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶迅速轉(zhuǎn)移到冰上，冷PBS沖洗2遍后，加入含有20mMMesNa的Tris緩沖溶液(pH8.6)在4℃下處理15min，去除仍存在于細(xì)胞膜上的生物素;加入20mM的碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)處理10min去除過量的MesNa;

9、收集細(xì)胞，提取蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行整合素αvβ6的capture-ELISA檢測(cè)。(2)胞吐實(shí)驗(yàn):開始步驟類似于內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)，只是將細(xì)胞生物素標(biāo)記后，在孵箱中培養(yǎng)30min，進(jìn)行一次MesNa溶液處理，再次放入孵箱中啟動(dòng)胞吐過程，待指定時(shí)間（0，5，10，30min等）后，取出細(xì)胞置于冰上，第二次用MesNa溶液去除細(xì)胞表面胞吐出的αvβ6，通過capture-ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)剩余未胞吐αvβ6的含量，從而判斷細(xì)胞αvβ6胞吐的時(shí)相及

10、比例。(3)Capture-ELISA:首先用5μg/ml10D5、0.05MNa2CO3(pH9.6)溶液在4℃下對(duì)96孔板進(jìn)行抗體包被過夜;用含0.05％Tween-20、5％BSA的PBS-T溶液在室溫下封閉1h;將50μl細(xì)胞裂解液置入包被完成的96孔板中，在4℃下孵育過夜，進(jìn)行β6的捕捉;未結(jié)合的細(xì)胞裂解產(chǎn)物物可以通過PBS-T大量沖洗去除;將96孔板在含有抗生物素蛋白鏈菌素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶（streptavidin-co

11、njugatedhorseradishperoxidase）并包含1％BSA的PBS-T作用下，4℃孵育1h;加入鄰苯二胺（ortho-phenylenediamine，OPD）顯色液室溫顯色10min，加入終止液終止反應(yīng)后492nm上機(jī)讀數(shù)。
　　 結(jié)果
　　 經(jīng)過對(duì)內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)、胞吐實(shí)驗(yàn)、capture-ELISA各種實(shí)驗(yàn)條件的摸索，初步構(gòu)建了整合素αvβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞中內(nèi)吞胞吐循環(huán)檢測(cè)體系，加入陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組對(duì)

12、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的敏感性和特異性進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。隨即對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29和WiDr分別進(jìn)行了整合素αvβ6內(nèi)吞和胞吐檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在這兩種細(xì)胞中，整合素αvβ6在進(jìn)行持續(xù)內(nèi)吞胞吐循環(huán)，內(nèi)吞比例在30min達(dá)到最大值，并且通過30min時(shí)間可有70％左右的整合素αvβ6重新胞吐到細(xì)胞表面。
　　 結(jié)論：
　　 在結(jié)腸癌HT29和WiDr細(xì)胞中，整合素αvβ6持續(xù)進(jìn)行內(nèi)吞胞吐循環(huán)，這是其一般性存在狀態(tài)，它的一切生物學(xué)行為必

13、將建立在這樣的運(yùn)動(dòng)模式基礎(chǔ)上。
　　 意義：
　　 該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體系的建立為進(jìn)一步研究整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)在調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中的作用及分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分整合素αvβ6-ERK2直接連接對(duì)αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)的影響
　　 目的
　　 探討整合素αvβ6-ERK2直接連接對(duì)αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)的影響。
　　 方法
　　 利用MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路中ERK

14、2上游MEK的抑制劑PD98059處理細(xì)胞抑制ERK2磷酸化，或轉(zhuǎn)染敲除ERK2結(jié)合位點(diǎn)的Del.Mutantβ6入SW480細(xì)胞(αvβ6陰性表達(dá))，利用內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)、胞吐實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在這種狀態(tài)下αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)時(shí)相，與自然狀態(tài)下的αvβ6的循環(huán)時(shí)相分析比較，確定干預(yù)整合素αvβ6-ERK2直接連接對(duì)αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)的影響。
　　 結(jié)果
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示抑制ERK磷酸化后可以抑制整合素αvβ6的內(nèi)吞過程，但對(duì)其胞吐過

15、程沒有影響，同樣，敲除β6胞內(nèi)段的ERK2結(jié)合位點(diǎn)能夠抑制αvβ6的內(nèi)吞過程，但對(duì)其胞吐過程幾乎沒有影響。值得注意的是，在內(nèi)吞起始5min內(nèi)，敲除β6胞內(nèi)段的ERK2結(jié)合位點(diǎn)能延緩內(nèi)吞過程，但PD98059對(duì)起始5min的內(nèi)吞過程沒有影響。
　　 結(jié)論：
　　 整合素αvβ6的內(nèi)吞啟動(dòng)過程在一定程度上受與之直接連接的ERK2磷酸化程度的影響，而且與ERK2連接，尤其是與磷酸化ERK2的連接，可以促進(jìn)整合素αvβ6的內(nèi)吞過

16、程的啟動(dòng)。
　　 意義：
　　 闡明了整合素αvβ6-ERK2直接連接在整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐過程中的作用和影響，為進(jìn)一步揭示該過程的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)在調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞遷移中的作用
　　 目的
　　 探討整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移過程中的作用。
　　 方法
　　 對(duì)整合素αvβ6陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)腸癌HT29細(xì)胞給予三種手段干預(yù)

17、，分別是10D5抗體功能性阻斷αvβ6、PD98059抑制ERK磷酸化、primaquine抑制胞內(nèi)空泡運(yùn)輸，通過遷移實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞在纖連蛋白表面遷移能力的改變;另外，向整合素αvβ6陰性表達(dá)的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染wild-typeβ6、Del.Mutantβ6和空載體，觀察這三種細(xì)胞遷移能力的差別，同樣對(duì)三種細(xì)胞給予10D5抗體、PD98059和primaquine處理，觀察對(duì)三種細(xì)胞遷移能力影響的不同。
　　 結(jié)果

18、r>　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10D5抗體、PD98059和primaquine均能夠抑制HT29細(xì)胞在纖連蛋白表面的遷移能力;SW480wild-typeβ6、SW480Del.Mutantβ6、SW480mock三種細(xì)胞在纖連蛋白表面的遷移能力明顯不同，SW480wild-typeβ6細(xì)胞明顯強(qiáng)于另外兩種細(xì)胞，提示整合素αvβ6及αvβ6-ERK2直接連接在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮重要作用;對(duì)SW480wild-typeβ6、SW480

19、Del.Mutantβ6、SW480mock三種細(xì)胞分別給予10D5抗體、PD98059和primaquine處理，均能夠明顯抑制SW480wild-typeβ6細(xì)胞在纖連蛋白表面的遷移能力，一方面說明這種遷移能力是由整合素αvβ6介導(dǎo)，另一方面也說明αvβ6-ERK2直接連接、αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)在其中發(fā)揮重要作用。
　　 結(jié)論
　　 結(jié)腸癌HT29細(xì)胞和SW480wild-typeβ6細(xì)胞在纖連蛋白表面的遷移主要是由

20、整合素αvβ6介導(dǎo)，而且在這個(gè)過程中整合素αvβ6-ERK2直接連接、整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)均發(fā)揮重要作用，在整合素αvβ6、αvβ6-ERK2直接連接、αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)三個(gè)水平給予干預(yù)均可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞在纖連蛋白表面的遷移能力。
　　 意義
　　 證實(shí)了整合素αvβ6在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移過程中的重要作用，并進(jìn)一步揭示了整合素αvβ6-ERK2直接連接、整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)在結(jié)腸癌細(xì)胞遷移過程中的作用。

21、>　　 第四部分
　　 PKC對(duì)整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)及其作用的影響
　　 目的
　　 探討PKC對(duì)整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)及其介導(dǎo)的細(xì)胞遷移的影響。
　　 方法
　　 首先，利用PKC激活劑PMA處理細(xì)胞，通過內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)、胞吐實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PKC激活對(duì)整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)的影響，同時(shí)給予PMA和PD98059處理，觀察整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)的變化;然后，在HT29細(xì)胞或SW480wil

22、d-typeβ6、SW480Del.Mutantβ6、SW480mock三種細(xì)胞中，給予PMA處理，并結(jié)合應(yīng)用10D5抗體、PD98059和primaquine等，觀察對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞在纖連蛋白表面遷移的影響。
　　 結(jié)果
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，PKC激活能夠促進(jìn)整合素αvβ6的內(nèi)吞胞吐循環(huán)，并且對(duì)內(nèi)吞、胞吐過程都有加速作用;同時(shí)應(yīng)用PMA和PD98059能夠在一定程度上抵消PKC激活對(duì)整合素αvβ6內(nèi)吞的影響，但對(duì)整合素αv

23、β6胞吐仍有促進(jìn)作用;PKC激活能夠促進(jìn)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞在纖連蛋白表面的遷移，同時(shí)應(yīng)用10D5抗體、PD98059和primaquine能在一定程度上抵消這種促進(jìn)作用;PKC激活能夠顯著促進(jìn)SW480wild-typeβ6細(xì)胞在纖連蛋白表面的遷移能力，但對(duì)SW480Del.Mutantβ6、SW480mock細(xì)胞影響不明顯。
　　 結(jié)論
　　 PKC激活能夠加速整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)，并能提高αvβ6表達(dá)陽(yáng)性結(jié)腸癌

24、細(xì)胞在纖連蛋白表面的遷移能力，而且這種促進(jìn)作用是通過整合素αvβ6依賴的方式實(shí)現(xiàn)的。
　　 意義
　　 闡明了PKC在整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)及其介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞遷移過程中的作用，為進(jìn)一步研究整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)的調(diào)控機(jī)制打下了基礎(chǔ)。
　　 第五部分
　　 高/低細(xì)胞密度培養(yǎng)對(duì)整合素αvβ6亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分布的影響
　　 目的
　　 研究在細(xì)胞高/低密度培養(yǎng)環(huán)境下整合素αvβ6在結(jié)腸癌

25、HT29細(xì)胞表面分布情況的改變，并通過整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)理論對(duì)這個(gè)現(xiàn)象進(jìn)行解釋。
　　 方法
　　 對(duì)于高、低細(xì)胞密度培養(yǎng)下的結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，分別通過內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)、胞吐實(shí)驗(yàn)檢測(cè)整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)時(shí)相的差異，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同細(xì)胞密度培養(yǎng)條件下HT29細(xì)胞表面整合素αvβ6數(shù)量改變，收集兩種狀態(tài)下的細(xì)胞，westernblot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中整合素αvβ6的含量，進(jìn)一步對(duì)這個(gè)現(xiàn)象進(jìn)行解釋。
　　

26、 結(jié)果
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，高密度培養(yǎng)條件下HT29細(xì)胞表面整合素αvβ6數(shù)量較多，并且高細(xì)胞密度培養(yǎng)能夠加速整合素αvβ6的內(nèi)吞胞吐循環(huán)過程，而在細(xì)胞總蛋白中整合素αvβ6的總量并沒有顯著變化。
　　 結(jié)論
　　 結(jié)腸癌細(xì)胞在高密度培養(yǎng)狀態(tài)下，細(xì)胞膜上整合素αvβ6數(shù)量增多是其在細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)重分布的結(jié)果，而整合素αvβ6內(nèi)吞胞吐循環(huán)在這個(gè)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)會(huì)動(dòng)員胞漿內(nèi)大量整合素αvβ6進(jìn)入內(nèi)吞