1、細(xì)胞核因子-1κB(Nuclear factorκappa B)是一種較特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)，對(duì)宿主先天性免疫反應(yīng)及細(xì)胞增殖、分化和凋亡起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB可以通過調(diào)控相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，參與機(jī)體的多種生理活動(dòng)，當(dāng)機(jī)體感染細(xì)菌或病毒等致病因素，其信號(hào)通路將在一系列酶的作用下被激活，參與宿主的免疫應(yīng)答，它的異?；罨赡苁荘RV導(dǎo)致免疫抑制的重要原因。為獲得豬NF-κB C-Rel亞基序列特性，對(duì)

2、PRV感染導(dǎo)致的免疫抑制與NF-κB表達(dá)異常的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究，本試驗(yàn)通過NCBI GeneBank中豬核轉(zhuǎn)錄因子-κB C-Rel亞基序列（XM_003125115）設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)NF-κBC-Rel全序列進(jìn)行克隆、序列鑒定及生物信息學(xué)分析;對(duì)PRV感染PK-15細(xì)胞對(duì)C-Rel轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響進(jìn)行分析;并構(gòu)建NF-κB C-Rel真核表達(dá)載體，對(duì)NF-κBC-Rel亞基真核表達(dá)產(chǎn)物對(duì)PRV復(fù)制的影響進(jìn)行探討，結(jié)果如下:
　　1

3、.豬核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB C-Rel亞基的克隆及序列鑒定本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法從豬外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增到NF-κB C-Rel ORF區(qū)并克隆至pMD19-T simple vector，克隆獲得陽性質(zhì)粒后測(cè)序，進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。序列分析結(jié)果表明:所擴(kuò)增豬C-Rel亞基ORF長(zhǎng)1773 bp，編碼590 aa;豬C-Rel核苷酸序列與不同動(dòng)物的C-Rel核苷酸序列相似性較高;大部分位于細(xì)胞核(76.0％)內(nèi)，無信號(hào)肽及跨膜區(qū)。

4、
　　2.PRV感染PK-15細(xì)胞對(duì)NF-κB C-Rel亞基mRNA轉(zhuǎn)錄時(shí)相的影響分析本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了NF-κB C-Rel亞基基因的熒定量檢測(cè)方法;運(yùn)用此方法對(duì)PK-15細(xì)胞感染PRV后，不同時(shí)段的細(xì)胞中C-Rel亞基mRNA轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行測(cè)定并分析。結(jié)果表明:標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)在一定的濃度范圍內(nèi)有極好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.998，擴(kuò)增效率為103.8％;特異性強(qiáng)，擴(kuò)增產(chǎn)物形成單一的特異性融解峰;靈敏性高，能檢出102copie

5、s/ul的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒;重復(fù)性好，組內(nèi)變異系數(shù)較小。PK-15感染PRV后，與對(duì)照組相比:0～4h，C-Rel轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，在2 h和4h差異顯著(P＜0.05);4～12h，C-Rel轉(zhuǎn)錄水平快速上調(diào)，12h達(dá)到轉(zhuǎn)錄高峰(P＜0.01);12 h后C-Rel轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降，24～120 h，均維持在較低水平，其中36h差異極顯著(P＜0.01)，48 h，72 h和120 h差異顯著(P＜0.05)。可見，PRV的感染會(huì)導(dǎo)致PK-15細(xì)

6、胞中NF-κB活化水平的降低，這與目前的相關(guān)研究結(jié)果基本相符。
　　3.豬NF-κappaB C-Rel亞基真核表達(dá)載體的構(gòu)建及C-Rel/P50/P65轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞對(duì)PRV增殖的影響本實(shí)驗(yàn)為了研究不同NF-κB(C-Rel/P65/P50)對(duì)PRV增殖的影響，成功構(gòu)建了pCDNA3.1(+)-C-Rel真核表達(dá)載體，與本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的P50，P65真核表達(dá)載體兩兩組合，應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，C-Rel、P50、P

7、65亞基的表達(dá)水平通過Westem-blot法被成功檢測(cè);將pCDNA3.1(+)空載體、pCDNA3.1(+)-C-Rel、pCDNA3.1(+)-C-Rel+pCDNA3.1(+)-P65、pCDNA3.1(+)-C-Rel+pCDNA3.1(+)-P50-RHD分別轉(zhuǎn)染至BHK21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染14h后接種PRV，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的PRV gE基因熒光定量PCR方法，對(duì)細(xì)胞上清中病毒粒子增殖時(shí)相進(jìn)行檢測(cè)，繪制PRV一步生長(zhǎng)曲線。本實(shí)驗(yàn)成

8、功構(gòu)建了豬pCDNA3.1(+)-C-Rel真核表達(dá)載體，且能夠在BHK21細(xì)胞中表達(dá);轉(zhuǎn)染C-Rel/C-Rel、C-Rel/P50-RHD、C-Re/P65真核表達(dá)質(zhì)粒均能促進(jìn)細(xì)胞病變的提前出現(xiàn);由各轉(zhuǎn)染組PRV一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果可知，C-Rel/C-Rel、C-Rel/P65能有效減緩PRV在BHK21細(xì)胞上增殖的進(jìn)程，其中，C-Rel/P65的抑制作用更強(qiáng)?？梢姡琋F-κB C-Rel/C-Rel、C-Rel/P65二聚體能在一定