1、帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一種中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，病理上主要表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的丟失死亡及路易小體形成。目前，對(duì)于膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)DA能神經(jīng)元的雙重作用的具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步闡明。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，采用SILAC、DIGE、生物質(zhì)譜等多種先進(jìn)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對(duì)與膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)DA能神經(jīng)元雙重作用相關(guān)的蛋白進(jìn)行了較大規(guī)模的篩選。并進(jìn)一步結(jié)合功能學(xué)方法，對(duì)蛋白

2、質(zhì)組學(xué)的結(jié)果進(jìn)行了分析和驗(yàn)證。 本課題共分為兩個(gè)部分：(一)對(duì)于膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用的研究：主要關(guān)注小膠質(zhì)細(xì)胞在致炎因子脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激早期的反應(yīng)。(二)對(duì)于膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)性作用的研究：主要關(guān)注膠質(zhì)細(xì)胞所釋放GDNF可能的下游信號(hào)分子。 第一部分：蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示小膠質(zhì)細(xì)胞在炎性刺激早期大量分泌溶酶體相關(guān)蛋白 LPS是一種強(qiáng)大的致炎因子、小膠質(zhì)細(xì)胞激活劑，被廣泛應(yīng)用于研究小膠

3、質(zhì)細(xì)胞在帕金森病等神經(jīng)變性性疾病中的作用。由于對(duì)于在致炎因素作用下小膠質(zhì)細(xì)胞的早期反應(yīng)目前仍然知之甚少。因此，本研究致力于用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法揭示膠質(zhì)細(xì)胞在LPS炎性刺激早期分泌蛋白的特征性變化。 1.蛋白質(zhì)組學(xué)研究：小膠質(zhì)細(xì)胞在脂多糖(LPS)刺激早期分泌蛋白的差異表達(dá)(1)取SpragueDawley大鼠全腦進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及純化，純度＞98％；(2)利用WesemBlot及ELISA的方法檢測(cè)了小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS刺激下

4、表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、前列腺素E2(PGE2)及其合成酶環(huán)氧化酶.2(COX-2)的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，顯示iNOS在LPS刺激后3小時(shí)表達(dá)，PGE2和COX-2在LPS刺激后24小時(shí)表達(dá)明顯。(3)選擇LPS刺激1小時(shí)為時(shí)間點(diǎn)，利用SILAC方法在細(xì)胞培養(yǎng)階段對(duì)蛋白進(jìn)行同位素標(biāo)記，質(zhì)譜液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行蛋白的鑒定及定量比較LPS刺激組和正常對(duì)照組兩組細(xì)胞培養(yǎng)基中分泌蛋白表達(dá)的差異。共有155個(gè)蛋白被成功鑒定。(4)

5、利用生物信息學(xué)分析軟件SignalP以及GenomeOntology數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)所鑒定蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位及生物學(xué)功能分類(lèi)。結(jié)果顯示，有77個(gè)蛋白符合分泌蛋白標(biāo)準(zhǔn)，其中，28個(gè)蛋白與溶酶體相關(guān)，13個(gè)溶酶體相關(guān)的蛋白的分泌水平在LPS刺激下發(fā)生了明顯的變化。 2.功能學(xué)研究：LPS刺激下小膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放的溶酶體相關(guān)蛋白對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用(1)利用WesternBlot的方法對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，均與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相

6、吻合。(2)利用共聚焦的方法觀(guān)察了cathepsinL與溶酶體標(biāo)志蛋白LAMP-1的共定位情況，這兩種蛋白在胞漿中的分布是共定位的，說(shuō)明在分泌蛋白中所檢測(cè)到的cathepsinL的確來(lái)源于小膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體。(3)利用ELISA的方法檢測(cè)了溶菌酶(lysozyme)的活力，相對(duì)于對(duì)照組而言經(jīng)LPS處理1小時(shí)的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中，該酶活力明顯上升。(4)檢測(cè)了小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)條件下20Schyrnotrypsin蛋白酶和postglutamy

7、l蛋白酶的活力，此兩種酶的活力在LPS處理的情況下相對(duì)于對(duì)照組，均未發(fā)生明顯改變。(5)檢測(cè)MES23.5細(xì)胞酪氨酸羥化酶蛋白豐度及多巴胺攝取能力，反映條件培養(yǎng)基作用下DA能神經(jīng)元的功能。結(jié)果顯示LPS刺激早期的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)DA能神經(jīng)元有毒性作用，溶酶體抑制劑NH4Cl可以明顯抑制該神經(jīng)毒性。 結(jié)論：小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS刺激早期大量釋放溶酶體相關(guān)蛋白，這些蛋白的早期釋放參與了小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)DA能神經(jīng)元的毒性作用。因此，本研究篩

8、選出大量與小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白，從而為下一步PD發(fā)病機(jī)制探索及臨床藥物篩選提供了線(xiàn)索；除此之外，本研究從全新的視角提出了小膠質(zhì)細(xì)胞參與PD等神經(jīng)變性性疾病發(fā)生過(guò)程的可能機(jī)制。 第二部分：磷酸化修飾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)下游信號(hào)分子 GNDF是由膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，被認(rèn)為是膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用最主要的途徑。它對(duì)DA能神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)及促生長(zhǎng)作用尤其明顯，被認(rèn)為是

9、神經(jīng)保護(hù)治療PD的首選神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。然而對(duì)于GDNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機(jī)制尚不完全清楚，因此，本研究致力于用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法尋找參與GDNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的可能的信號(hào)分子。 1.蛋白質(zhì)組學(xué)研究：PC12細(xì)胞在GDNF刺激下發(fā)生調(diào)變的磷酸化蛋白譜(1)觀(guān)察GDNF所引發(fā)的雙轉(zhuǎn)GFRαl和RET的PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)作用，200ng/mlGDNF刺激12小時(shí)以?xún)?nèi)，無(wú)明顯的軸突生長(zhǎng)；(2)取GDNF處理0.5小時(shí)和10小時(shí)作為時(shí)間點(diǎn)，利用D

10、IGE方法對(duì)所純化的磷酸化蛋白進(jìn)行標(biāo)記，雙向電泳-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行蛋白的鑒定及定量比較GDNF刺激組和正常對(duì)照組兩組細(xì)胞磷酸化蛋白表達(dá)的差異，串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行差異蛋白的鑒定。125差異點(diǎn)中，共有92個(gè)點(diǎn)被成功鑒定。(3)利用生物信息學(xué)分析軟件Cluster和Treeview對(duì)所獲得差異蛋白進(jìn)行叢集性分析，用生物信息學(xué)GenomeOntology數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)所鑒定蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位及生物學(xué)功能分類(lèi)。結(jié)果顯示，共有75個(gè)點(diǎn)的蛋白在GDNF處理的兩個(gè)

11、時(shí)間點(diǎn)上均發(fā)生了上調(diào)(鑒定出來(lái)58個(gè)點(diǎn)，代表47個(gè)基因)，大部分蛋白(74.1％)具有“捆綁”(binding)的功能，部分蛋白具有水解酶活力(20.4％)。 2.功能學(xué)研究：小熱休克蛋白27(hsp27)的磷酸化參與GDNF引起的軸突生長(zhǎng)(1)利甩WesternBlot及RT-PCR的方法對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在GDNF刺激下，PC12雙轉(zhuǎn)細(xì)胞的Hsp27總蛋白表達(dá)水平不變，磷酸化蛋白水平有所上調(diào)，與蛋白質(zhì)組學(xué)

12、結(jié)果一致；(2)利用共聚焦顯微鏡技術(shù)及WesternBlot觀(guān)察，在GDNF刺激下，Hsp27迅速發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)位，24小時(shí)復(fù)位至胞漿，此過(guò)程伴隨著核內(nèi)磷酸化Hsp27的明顯上調(diào)。(3)構(gòu)建了聯(lián)合表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的RNAi干擾質(zhì)粒，對(duì)PC12雙轉(zhuǎn)細(xì)胞的Hsp27成功干擾后，GDNF引起的軸突生長(zhǎng)作用明顯受到抑制。(4)構(gòu)建了聯(lián)合表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的野生型及特異性磷酸化位點(diǎn)定點(diǎn)突變的Hsp27質(zhì)粒，結(jié)果表明，顯性負(fù)向突變可使GDNF