1、目的：建立穩(wěn)定表達(dá)乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)的小鼠成纖維細(xì)胞系PA317/BCRP，進(jìn)一步研究BCRP相關(guān)的耐藥功能，初步探討其耐藥機制，為逆轉(zhuǎn)其耐藥提供依據(jù)。 方法：首先，從表達(dá)BCRP的乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞系MCF-7/Adr中，克隆出BCRP基因。將BCRP編碼序列克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.ColiDH5α，獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1/BCRP，酶切并測序鑒定。我們將測序正確的質(zhì)粒用電穿孔法轉(zhuǎn)染PA

2、317細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/EGFP以觀察轉(zhuǎn)染率。G418篩選陽性克隆，有限稀釋法獲取單克隆后擴大培養(yǎng)。從G418篩選出的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法檢測BCRP的mRNA表達(dá)，運用WESTERNBLOT法和免疫組織化學(xué)法檢測BCRP蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)。經(jīng)驗證正確的耐藥克隆命名為PA317/BCRP，擴大培養(yǎng)并凍存。為驗證其耐藥功能，我們采用MTT法檢測PA317/BCRP細(xì)胞對米托葸醌(Mitoxantr

3、one，MTZ)耐藥性，羅丹明123外排實驗驗證轉(zhuǎn)染后細(xì)胞外排羅丹明123功能，均以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的PA317細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。此外，應(yīng)用Westernblot檢測PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游靶點AKT表達(dá)含量的變化，以初步探討其細(xì)胞耐藥機制。 結(jié)果：成功構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1/BCRP，轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞后經(jīng)G418篩選，克隆化培養(yǎng)后獲得兩株抗藥性細(xì)胞系。經(jīng)RT-PCR法，Westernblot和免疫組化法驗證，均檢

4、測到細(xì)胞中BCRP基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)。遂將驗證正確的細(xì)胞系命名為PA317/BCRP，擴大培養(yǎng)并凍存。與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照組相比，PA317/BCRP細(xì)胞對MTZ耐藥性增強，且外排羅丹明123能力增強。耐藥機制方面，我們經(jīng)檢測PI3K-AKT途徑下游靶點AKT蛋白磷酸化水平在PA317/BCRP細(xì)胞內(nèi)明顯增高，其磷酸化AKT蛋白含量為PA317/pcDNA3.1細(xì)胞的10.87倍，為未轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞的13.18倍。

5、 結(jié)論：1、成功獲得穩(wěn)定表達(dá)BCRP的PA317細(xì)胞系--PA317/BCRP，經(jīng)MTT和羅丹明123外排實驗證實，相對于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的PA317細(xì)胞，其耐藥和外排功能增強。該耐藥細(xì)胞系的建立，為研究BCRP腫瘤多藥耐藥提供了研究平臺。2、通過檢測PA317/BCRP細(xì)胞PI3K-AKT途徑下游靶點AKT的表達(dá)，我們觀察到耐藥細(xì)胞的AKT表達(dá)含量明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的PA317細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為BCRP可能通過影響AKT