1、南昌大學醫(yī)學院博士學位論文AFP-L3核酸適配子的篩選鑒定及其對肝細胞癌診斷價值的初步研究姓名：方念申請學位級別：博士專業(yè)：內科學（消化系病）指導教師：張焜和20080601摘要和力較理想的適配子分別與肝細胞癌患者、慢性病毒性肝炎患者及正常人血清結合孵育，過濾并收集濾液，以濾液為模板進行實時熒光定量P C R 檢測，作R O C曲線，初步評估適配子對肝癌的診斷價值。結果：( 1 ) 寡核苷酸文庫和引物序列：單鏈隨機寡核苷酸( s s D

2、 N A ) 文庫的序列為：5 ' - A C CG A C C G T G C T G G A C T C T ( N 4 0 ) A G T A T G A G C G A G C G TT G c G ．3 7 ，上游引物序列：5 ' - A C CG A C C G T G C T G G A C T C T - 3 ’，下游引物序N - 5 ' - C G C A A C G C T C G C T C

3、 A T A C T - 3 ’。( 2 ) 文庫P C R 擴增的優(yōu)化條件：最佳退火溫度6 8 ℃，并采用兩溫法擴增；不對稱P C R 的最佳引物比例是2 0 ：l ，熱循環(huán)次數(shù)為2 0 ：以6 8 ℃的退火溫度進行實時熒光定量P C R ，能準確而穩(wěn)定地定量文庫模板量。( 3 ) A F P ．L 3 蛋白的適配子篩選：經(jīng)過1 3 輪S E L E X 篩選，適配子文庫得到明顯富集，結合率由起始的5 ．1 ％升高至4 8 ．2 ％。

4、( 4 ) 適配子分離和測序：應用聚合酶鏈式反應．單鏈構象多態(tài)性( P C R ．S S C P ) 分析技術成功分離到7 種適配子，克隆測序證實各適配子的固定區(qū)序列與設計的序列相同，而隨機區(qū)序列各不相同，模擬分析的二級結構也各不相同，分子構象主要有口袋型和發(fā)卡型兩種。( 5 ) 適配子特性鑒定：各適配子與A F P ．L 3 結合均有較強的特異性，其中S 4 和S 7 最強；適配子S 4 和S 7 與A F P ．L 3 結合的解離常

5、數(shù)分別是6 5 0 n m o l ／L 和1 3 2 n m o l ／L ，有較高的親和力。( 6 ) 適配子對肝癌診斷價值的初步研究：適配子S 7 與肝細胞癌患者的血清結合率為0 ．5 4 1 4 - 0 ．1 1 6 ，與慢性肝炎患者的血清結合率為0 ．3 8 2 + 0 ．1 0 2 ，與正常人血清的結合率為0 ．4 1 2 - - 1 = 0 ．1 2 0 ，以0 ．4 7 9為臨界值，R O C 曲線下面積為0 ．8 3

6、9 ，診斷肝癌的敏感性為7 5 ．O ％，特異性8 3 ．3 ％，準確率為8 0 ．6 ％，陽性預測值為6 9 ．2 ％，陰性預測值為8 3 ．3 ％。結論：本研究通過自行設計隨機s s D N A 文庫及相應的引物，在優(yōu)化文庫的P C R 擴增條件后進行A F P ．L 3 蛋白的適配子篩選，并以P C R ．S S C P 技術分離單一適配子，引入實時熒光定量P C R 技術鑒定適配子的特性及其對肝癌的診斷價值，獲得滿意的實驗結果，

7、得出以下結論： ( 1 ) 建立起較傳統(tǒng)方法更為簡便易行的適配子篩選技術，并篩選出7 個A F P ．L 3 核酸適配子： ( 2 ) 核苷酸測序顯示各適配子的兩端固定區(qū)序列與設計的寡核苷酸序列相符，隨機區(qū)各不相同，計算機模擬分析的二級結構也各不相同； ( 3 ) 各適配子與A F P —L 3 蛋白結合均有較好的特異性，但各適配子之間強弱不等，以S 4 和S 7 最強； ( 4 ) 特異性較強的適配子S 4 和S 7 與A F P ．