1、目的:從鈣化胎盤組織及其臍帶血標(biāo)本中分離鑒定納米細(xì)菌（Nanobacteria，NB），經(jīng)鑒定的NB作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞的影響，并測定細(xì)胞內(nèi)與鈣化相關(guān)的骨形態(tài)蛋白-2(Bonemorphogenetic protein2，BMP-2)，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)以及與凋亡相關(guān)的Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表達(dá)，最終探討NB導(dǎo)致鈣化的可能機(jī)制。
　　 方法:收集孕婦胎盤鈣化組織及其臍帶

2、血20例，并以相同條件下取得的20例正常孕婦胎盤組織作對照組，分離培養(yǎng)NB;用革蘭染色、茜素紅染色、掃描電鏡和透射電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。經(jīng)鑒定NB與納米羥基磷灰石（Nanohydroxyapatite，nHA）均以2麥?zhǔn)蠞岫?M)，分別作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)24h、48h、72h后通過CCK-8試劑盒檢測其對細(xì)胞的抑制作用;經(jīng)12h、24h、48h、72h，取上清經(jīng)全自動生化分析儀通過檢測LDH、ALP的活性，反映其損傷

3、和鈣化情況;72h后經(jīng)流式細(xì)胞儀(FCM)測定凋亡率;透射電鏡(TEM)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;提取細(xì)胞總蛋白，Western blot的方法測定細(xì)胞中鈣化相關(guān)蛋白BMP-2，OPN，以及線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax的表達(dá)情況。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5進(jìn)行雙因素或單因素方差分析并繪圖，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:培養(yǎng)沉淀物符合文獻(xiàn)描述的NB特性。油鏡下臍帶血和鈣化胎盤組織分離的NB為球狀或桿狀

4、，多成球形，形態(tài)相似;茜素紅染色結(jié)果表明，臍帶血NB較多且聚集成簇;透射電鏡和掃描電鏡下NB呈球形，大小為80～500 nm，并可見毛刺結(jié)構(gòu)。NB分離率:臍帶血為80％(16/20)，鈣化胎盤組織為65％(13/20)，與正常胎盤組織10％(2/20)比較，x2分別為12.07，9.09，P均＜0.01，有統(tǒng)計學(xué)意義;臍帶血與鈣化胎盤組織比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(x2=1.33，P＞0.05)。2M濃度的NB和nHA作用于乳腺癌細(xì)胞后CC

5、K-8顯示，NB組24h，48h，72h對細(xì)胞的抑制作用均強(qiáng)于nHA組和正常對照組，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義;NB組ALP、LDH活性在24h，48h，72h時均高于正常對照組，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義，24h，48h，72h均高于nHA組，但僅在24h，48h有統(tǒng)計學(xué)差異;72h后NB組細(xì)胞凋亡率高于nHA組，P＜0.001;透射電鏡下觀察，NB組可以看到胞質(zhì)空泡樣變，核固縮，以及明顯的凋亡小體形成，nHA組未見明顯異常;72h后

6、NB組:BMP-2的表達(dá)高于正常，t=5.52，P＜0.01，有顯著性差異，高于nHA組，但無統(tǒng)汁學(xué)意義;OPN，Bax的表達(dá)量均高于正常組和nHA組，P＜0.001，均有顯著性差異;Bcl-2的表達(dá)降低，與正常組相比，t=6.12，P＜0.01，有顯著性差異，低于nHA組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:胎盤鈣化與NB感染有關(guān)，鈣化產(chǎn)生的機(jī)制可能是HA及NB的其他組成成分或代謝產(chǎn)物在一定程度上抑制細(xì)胞生長，增強(qiáng)Bax蛋白的表達(dá)，