1、背景和目的 據UICC World Cancer Congress 2006報道，惡性腫瘤仍然是21世紀嚴重危害人類生命健康的主要疾病。全球年新發(fā)腫瘤病例約1100萬，死亡700萬，現患病例2500萬。以此趨勢，至2020年，每年新發(fā)病例將達1600萬，死亡1000萬。目前，我國年發(fā)病人數約200萬，死亡150萬；在城鎮(zhèn)居民中，惡性腫瘤仍是死亡的主要原因。 研究表明肝細胞生長因子(hepatocyte growth fa

2、ctor，HGF)異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后密切相關。HGF作為一種多功能細胞因子，主要經旁分泌(基質細胞)或自分泌(腫瘤細胞)途徑產生，通過HGF/Met信號途徑，激活受體酪氨酸激酶，使下游的信號分子磷酸化，產生系列的生物學效應，主要表現為絲裂原、能動原、形態(tài)發(fā)生原效應和促血管新生，促進腫瘤的生長、遷徙和侵襲。對霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤等研究發(fā)現HGF與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展可能存在相互促進關系：HGF

3、的高分泌促進淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展，而淋巴瘤細胞的增殖又促進HGF自分泌。還證實hGF水平與淋巴瘤的臨床療效、預后等密切相關，是一個值得進一步研究的指標。因此，阻斷HGF/Met系統(tǒng)的信號轉導可能成為抗腫瘤治療的新策略之一。就現研究而言，NK4是理想的HGF/Met信號途徑阻斷劑，其機制在于能全面拮抗HGF活性。NK4是HGF的一個含447個氨基酸殘基的片段，保留了HGF與其受體c-MET的結合部位，能和HGF競爭性結合受體c-MET，但結

4、合后不能使后者發(fā)生磷酸化，從而抑制HGF的誘導腫瘤生長、侵襲、遷徙和促血管新生等生物活性。研究證實NK4具二重功能：HGF的抑制劑和非依賴于HGF的血管新生抑制劑，具腫瘤治療價值。對肺癌、大腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、纖維肉瘤等多種惡性腫瘤的研究證實，NK4具有顯著的抑瘤效應，是HGF相關研究中的重點之一。 但迄今國內外尚無NK4對淋巴瘤抑制作用的相關研究。 直接使用NK4蛋白和通過

5、載體介導NK4基因轉染后的表達是目前主要的研究方法。后者最為常用，根據導入方式分直接導入和轉染后導入兩種技術。直接導入法不需轉染細胞，可直接進行瘤內或腹腔內注射且可反復加強，但持續(xù)表達時間短。轉染后導入法需先構建其表達載體，再以適當方法轉染細胞，然后進行體內或體外實驗，雖操作復雜，但因轉染后可獲穩(wěn)定、高效表達，效果更理想。 因此，在本研究中我們試圖通過NK4基因轉染Raji細胞，探索NK4對淋巴瘤的抑制作用。擬綜合應用分子生物學

6、、細胞生物學、免疫組化等多項技術，如細胞培養(yǎng)、基因克隆、基因轉染、半固體培養(yǎng)、實時FQ-PCR、免疫細胞化學、ELISA等，進行相關工作。 方法 在第一部分，根據靶序列設計引物，采用RT-PCR，獲得NK4、c-MET和HGF的特異性目的片段，分別與載體pGEM-T Easy和pMD19-T Simple構建相應重組質粒，作為定量標準；優(yōu)化反應條件和組分濃度，分別建立NK4 mRNA、c-METmRNA和HGF mRNA

7、相應的實時FQ-PCR，并進行方法學評價。 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5％的基礎上，對上層膠瓊脂糖濃度(0.1％～0.5％)和細胞濃度(100個/孔～5000個/孔)進行選擇，改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。 根據真核載體pVITRO2 MCS2的酶切位點，設計引物，經RT-PCR獲得NK4和HGF全長片段，與載體pMD19-T Simple重組，鑒定確認序列正確后擴大、提純，酶切后回收目的片段分別與和pVITRO2重組，構

8、建重組真核表達質粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGFWhole。 在第二部分，重組質粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGFWhole以陽離子脂質體法分別轉染Raji細胞，經潮霉素B篩選、RT-PCR、ELISA和免疫細胞組化等方法，鑒定轉染細胞成功與否；通過繪制生長曲線、觀察克隆形成能力和生長特點，評價NK4基因、HGF基因轉染對Raji細胞生物性狀的影響；采用實時FQ-PCR檢測轉

9、染細胞c-MET mRNA的表達變化；采用ELISA.檢測NK4基因、HGF基因轉染后的磷酸化c-MET蛋白的變化。綜合以上結果評價NK4基因轉染對Raji細胞的增殖、遷徙和侵襲的抑制作用。 此外，使用10ng/ml HGF蛋白、100ng/ml NK4蛋白分別處理NK4轉染細胞、HGF轉染細胞，通過觀察克隆形成能力、生長特點、mRNA表達、磷酸化c-MET蛋白等指標的變化，評價NK4蛋白對Raji細胞的抑制作用和NK4基因轉染

10、對HGF蛋白的拮抗作用。結果在第一部分，我們構建了的重組質粒pGEM-T Easy-NK4、pGEM-TEasy-C-MET和pMD19-T Simple-HGF，分別作為NK4 mRNA、c-METmRNA和HGF mRNA的定量標準。分別設計第二引物對和探針，優(yōu)化了引物、探針、dNTPs和MgCl2的濃度和反應條件，建立了分別檢測NK4 mRNA、c-MET mRNA和HGF mRNA的實時FQ-PCR。經方法學評價試驗證實：NK4

11、、c-MET和HGF的mRNA實時FQ-PCR的標準曲線斜率分別為-3.5 13±0.028、-3.680±0.073、-3.710±0.011，相關系數分別為0.999、0.996、0.998，擴增效率分別達92.6±1.0％、87.6±1.4％、86.0±0.4％；批內、日內、日間變異系數分別為2.1％、4.0％、6.8％，1.9％、3.9％、7.0％，2.5％、3.1％、8.3％；靈敏度分別達2、5、5拷貝/μl。 篩選后

12、確定上層膠瓊脂糖濃度為0.3％、細胞濃度為1000個/孔，結合0.5％瓊脂糖底層膠建立半固體培養(yǎng)體系。經RT-PCR獲得全長序列的NK4 cDNA和HGF cDNA，并由此構建了真核表達重組質粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGF Whole，經PCR、酶切和測序等證實NK4 cDNA和HGF cDNA成功重組并保持序列完整和正確。 在第二部分，重組質粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-H

13、GFWhole分別轉染Raji細胞。潮霉素B篩選后的轉染細胞經RT-PCR確認存在目的片段，培養(yǎng)液中NK4蛋白、HGF蛋白含量分別為4.14±0.19ng/ml和5.38±0.31ng/ml，免疫細胞組化結果呈陽性，提示轉染成功，獲得轉染細胞株。 NK4轉染細胞和HGF轉染細胞達生長曲線峰值的時間分別為5天和3天，與對照組(未轉染Raji細胞、空載體pVITRO2轉染細胞均為4天)相異；前者形成的細胞團較小、邊緣整齊、散在細胞少，而后者

14、的細胞團松散、邊緣不整齊、細胞呈擴散性生長；兩組的c-MET mRNA分別為5.71±0.29和6.48±0.18，磷酸化c-MET蛋白分別為3.35±0.38U/ml和4.96±1.18U/ml；克隆形成數分別為64.39±4.63/孔和124.61±5.16/孔，與對照組相比，差異顯著(P＜0.001)，兩組間差異也具高度統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。結果提示，NK4基因轉染抑制了Raji細胞的生長，而HGF基因轉染促進了其生長。

15、 此外，NK4蛋白處理的HGF轉染細胞組的克隆形成能力降低(89.78±5.38/孔)、處理后10min的c-MET mRNA增高(7.67±0.20)、HGF mRNA表達顯著增強(9.16+0.14)而磷酸化c-MET蛋白降低(8.97±1.19U/ml)；HGF蛋白處理的NK4轉染細胞組的克隆形成能力明顯增加(64.39±4.63/孔)、處理后10min的c-MET mRNA明顯增強(8.10±0.22)、NK4 mRNA(

16、9.73±0.34)和磷酸化c-MET蛋白(65.24±2.04U/ml)均顯著增強，分別與對照組及未處理組的差異均有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。提示NK4蛋白促進了HGF轉染細胞c-MET mRNA、HGF mRNA的應激性表達加強，而抑制了克隆的形成和c-MET蛋白磷酸化；HGF蛋白有助于NK4轉染細胞的克隆形成，促進c-MET mRNA、NK4mRNA的表達和c-MET蛋白的磷酸化。研究結論1.構建了定量標準，分別建立了HG

17、F mRNA、NK4 mRNA和c-MET mRNA相應的實時FQ-PCR。 2.建立了適宜的半固體培養(yǎng)體系。 3.構建了真核表達重組質粒pVITRO2-NK4 Whole和pVITRO2-HGF Whole。 4.成功轉染Raji細胞，獲得NK4基因轉染細胞株和HGF基因轉染細胞株。 5.NK4基因轉染對Raji細胞具抑制作用，而HGF基因轉染則具促進作用。 6.NK4蛋白抑制HGF基因轉染細胞