1、目的：通過(guò)培養(yǎng)PA-1細(xì)胞,并且進(jìn)行苦參堿(MAT)干預(yù),觀察其作用后細(xì)胞的形態(tài)變化,檢測(cè)其增殖活力的變化,同時(shí)檢測(cè)一些凋亡相關(guān)基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平的變化,從細(xì)胞分子生物學(xué)的水平觀察MAT處理PA-1細(xì)胞后,各個(gè)因子在凋亡發(fā)生過(guò)程中的作用,初步探討PA-1細(xì)胞凋亡的機(jī)制,為MAT對(duì)該腫瘤的臨床治療提供基礎(chǔ)研究. 方法：本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,為ATCC細(xì)胞庫(kù)收錄. 1.對(duì)PA-1細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇和傳

2、代培養(yǎng),通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算其DOT(倍增時(shí)間). 2.用不同濃度的MAT處理細(xì)胞,分別在處理后不同的時(shí)間點(diǎn),以MTT法檢測(cè)MAT對(duì)PA-1細(xì)胞增殖活性的影響. 3.用光學(xué)倒置顯微鏡從形態(tài)學(xué)的角度研究PA-1細(xì)胞在MAT誘導(dǎo)凋亡前后的顯微結(jié)構(gòu)特征的變化. 4.用DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化. 5.Annexin V FITC和PI雙染后細(xì)胞樣品置于免疫熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài). 6.用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)

3、定不同濃度MAT對(duì)細(xì)胞凋亡的影響. 7.用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度MAT對(duì)細(xì)胞周期的影響. 8.用半定量RT-PCR檢測(cè)MAT誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中人類凋亡受體Bcl-2/Bax的表達(dá)水平的變化,以β-actin為內(nèi)參照,目的基因的PCR產(chǎn)物條帶灰度Volume之比作為反映目的基因mRNA水平的相對(duì)指標(biāo). 結(jié)果：1.經(jīng)復(fù)蘇以后的PA-1細(xì)胞增殖穩(wěn)定,以1:8的比率傳代,隔天換液一次,3天傳代一次.細(xì)胞群體倍增時(shí)間為26h.

4、 2.光鏡結(jié)果顯示加藥組細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組明顯減少,形態(tài)皺縮,胞內(nèi)明顯出現(xiàn)圓形空泡,且呈劑量依賴性,而正常組與對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯變化. 3.MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MAT作用后細(xì)胞的增殖受到了抑制,隨著濃度和時(shí)間的增加,其抑制作用增強(qiáng),與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05). 4.DAPI染色顯示MAT作用24h后,1.0、0.5、0.25mg/ml濃度組中可見(jiàn)較多明顯的核固縮,且核固縮的比例依濃度呈現(xiàn)一定的梯度,而對(duì)照

5、組中未見(jiàn)明顯的核固縮,證實(shí)MAT有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用. 5.可見(jiàn)Annexin V FTTC僅著色于細(xì)胞膜表面的早期凋亡細(xì)胞(圖6.)及Annexin V FITC和PI均著色于細(xì)胞上、整個(gè)細(xì)胞濃染的晚期凋亡細(xì)胞(圖7.),證實(shí)MAT有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用. 6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,MAT作用24h后對(duì)PA-1細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用,且在1.0、0.5、0.25mg/ml濃度組中,凋亡率與藥物濃度成正比,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義(P<0.05). 7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)MAT作用后G<.1>期細(xì)胞比例均增高,S期細(xì)胞比例降低,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).且在1.0、0.5、0.25mg/ml濃度組中G<,1>期阻滯作用與藥物濃度成正比. 8.RT-PCR結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度的MAT處理后的PA-1細(xì)胞的bc1-2/baxmRNA表達(dá)水平均下調(diào).且呈濃度依賴性. 結(jié)論：1.MAT對(duì)PA-1細(xì)胞有明顯抑制作用,且表現(xiàn)出良好