1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　第一部分 DSTD對骨肉瘤細胞增殖、凋亡和M I F表達水平的影響
　　目的：
　　探討DSTD對骨肉瘤細胞MG-63和U2OS增殖、凋亡的影響及MIF表達水平的影響。
　　方法：
　　1.用含10％小牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63和U2OS細胞，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　2.用MTT實驗和LDH釋放實驗檢測不同濃度DSTD

2、(0、1uM、10uM、50uM、100uM)分別處理細胞24h后，統(tǒng)計DSTD對細胞增殖和凋亡的影響及濃度依賴性。
　　3.100uM DSTD作用于MG-63和U2OS細胞24h后，用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞內MIF mRNA的含量的變化，用Western Blot法檢測細胞內MIF蛋白表達情況。
　　結果：
　　1.DSTD能抑制MG-63和U2OS細胞的生長，且呈一定濃度依賴性，但與

3、對照組相比，差異無顯著統(tǒng)計學意義。100uM DSTD作用于MG-63和U2OS細胞24小時沒有明顯改變細胞的增殖活力和細胞的凋亡率。
　　2.Real-time PCR結果:100uM DSTD處理MG-63和U2OS細胞24h后可顯著降低MIF mRNA的轉錄水平。
　　3.Western Blot結果:100uM DSTD處理MG-63和U2OS細胞24h后，MIF蛋白表達水平明顯降低。
　　結論：
　　D

4、STD沒有明顯影響人骨肉瘤細胞MG-63和U2OS的增殖活性和凋亡水平，但明顯減少了人骨肉瘤細胞MG-63和U2OS的MIF表達水平。
　　第二部分 DSTD通過抑制MIF的表達誘導骨肉瘤細胞ROS介導的自噬的研究
　　目的：
　　通過研究DSTD作用于骨肉瘤細胞MG-63和U2OS后檢測MIF和自噬相關蛋白的表達，探討DSTD誘導骨肉瘤自噬發(fā)生中的作用及分子機制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)MG-63和

5、U2OS細胞株，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗研究。
　　2.100uM DSTD處理骨肉瘤細胞MG-63和U2OS24h后和MIF ShRNA處理細胞48h后，分離細胞核和細胞質蛋白，用Western Blot檢測MIF、Bcl-2、Bax、pERK、Cyto HMGB1、Nucleic HMGB1蛋白的表達水平。
　　3.100uM濃度的DSTD作用于MG-63細胞和U2OS細胞不同時間(0h、4h、8h、12h、24h、4

6、8h)后用Westren Blot檢測自噬相關基因LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表達水平。
　　4.不同濃度DSTD(0uM，50uM、100uM)作用于骨肉瘤細胞U2OS和MG-6324h后用Western Blot檢測MIF、Bcl-2、Bax、pERK、HMGB1、LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ蛋白的表達水平。
　　5.用100uM DSTD與15mM NAC單獨及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細胞不同時間后，分離細胞核

7、和細胞質蛋白，用Western Blot檢測MIF、Bcl-2、Bax、pERK、PARP、c-PARP、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Histone H3、Cyto HMGB1、NucleicHMGB1蛋白的表達水平。
　　6.MTT實驗和LDH釋放實驗:用100uM DSTD與15mM NAC單獨及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細胞不同時間后，MTT法測定細胞增殖抑制率，LDH釋放實驗測定細胞毒性。
　　7.Annexin

8、Ⅴ/PI(AnnexinⅤ-FITC)雙染法流式細胞術測定細胞凋亡率:選用100uM DSTD或15mM NAC單獨及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細胞不同時間后，用流式細胞儀(Beckman Coulter)進行檢測分析凋亡。
　　8.DCF-DA法測定活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS):選用100uM DSTD或15mM NAC單獨及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細胞不同時間后，ROS的產生

9、用氧化反應敏感的熒光試劑DCF-DA檢測。
　　9.免疫熒光:選用100uM DSTD或15mM NAC單獨及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細胞不同時間后，細胞用含4％多聚甲醛的PBS溶液固定30分鐘，再用含0.2％ Triton x-100的PBS滲透15分鐘。隨后細胞用10％的正常山羊血清封閉非特異性結合位點，室溫放置1小時。
　　結果：
　　1.100uM DSTD和MIF shRNA均顯著地抑制了MIF的表達，

10、同時導致了Bcl-2的明顯減少和Bax的明顯增加（Bax/Bcl-2比值上調），抑制了ERK的磷酸化。胞核HMGB1的含量減少，而胞漿HMGB1含量增加。
　　2.當用100uM DSTD作用于骨肉瘤細胞株24小時后，LC3B-Ⅰ明顯地發(fā)生了向LC3B-Ⅱ的轉化。LC3B-Ⅱ富集的量與DSTD作用時間呈正相關，這提示DSTD誘導的自噬呈現(xiàn)時間依賴性。
　　3.分別用不同濃度DSTD處理U2OS和MG-63細胞24h后，免疫蛋

11、白印跡表明，隨著DSTD濃度的增加，U2OS和MG-63細胞中MIF、Bcl-2、pERK、HMGB1的表達逐漸降低，而Bax的表達逐漸增加。隨著DSTD濃度的增加LC3B-Ⅱ富集量也逐漸增加。這提示DSTD誘導的自噬呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　4.我們檢測了抗氧化劑NAC對DSTD誘導的信號傳導的作用。Wetern blot結果顯示，NAC共刺激逆轉了DSTD誘導的信號傳導途徑，但DSTD誘導的PARP的富集和PARP的剪切激活（c-

12、PARP的形成）不能被NAC共刺激逆轉。
　　5.MTT結果顯示抗氧化劑NAC共刺激后細胞增殖明顯降低，LDH釋放實驗顯示NAC共刺激后細胞毒性增加。
　　6.流式細胞術結果顯示，NAC共刺激促進了細胞凋亡。
　　7.熒光素乙二脂染色法(DCF-DA)來追蹤人骨肉瘤細胞株中ROS的產生。實驗發(fā)現(xiàn)，ROS的產生量隨著DSTD作用時間的增加而增高，但卻能被NAC抑制。
　　8.免疫熒光檢測DSTD誘導的自噬，結果顯示

13、LC3的形成很明顯，且呈時間依賴性。NAC共刺激減輕了DSTD誘導的自噬。
　　9.3-MA能夠減少DSTD誘導人骨肉瘤細胞U2OS和MG-63產生的LC3B-Ⅱ表達水平。3-MA引起的自噬抑制作用也抑制了細胞增殖，并且促進了細胞凋亡，這提示我們DSTD誘導的自噬確實能延緩細胞死亡。
　　結論：
　　DSTD可通過抑制MIF誘導U2OS和MG-63細胞發(fā)生自噬，且呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。DSTD誘導的自噬是ROS介導的，

14、并且自噬延緩了細胞死亡。
　　第三部分 DSTD對骨肉瘤細胞耐藥性的影響及機制
　　目的：
　　探討DSTD在骨肉瘤細胞化療藥物耐藥中的作用及其分子機制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)MG-63和U2OS細胞株，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗研究。
　　2.用0.5uM的阿霉素或50uM的順鉑在100uM的DSTD存在或不存在的情況下處理24h后在顯微鏡下觀察人骨肉瘤細胞U2OS和MG-63形態(tài)的改變。<

15、br>　　3.MTT實驗檢測不同濃度化療藥物阿霉素或順鉑單獨及聯(lián)合DSTD對人骨肉瘤細胞增殖活性的影響。
　　4.細胞用0.5uM的Dox或50uM的Cis在100uM的DSTD存在或不存在的情況下共刺激MG-63和U2OS細胞24h。
　　5.MG-63和U2OS細胞轉染GV230-HMGB1質粒DNA72h后，WesternBlot檢測HMGB1過表達對HMGB1、pERK、LC3和PARP蛋白表達的影響，LDH釋放實驗

16、檢測HMGB1過表達對細胞凋亡的影響。
　　結果：
　　1.與對照組比較，DSTD導致細胞輕微的皺縮，而阿霉素和順鉑部分導致細胞皺縮。在DSTD和化療藥物阿霉素或順鉑一起聯(lián)合作用于人骨肉瘤細胞的時候，引起了大批的細胞死亡。
　　2.化療藥物阿霉素和順鉑以劑量依賴的方式減少了細胞增殖。DSTD與化療藥物阿霉素或順鉑聯(lián)合使用比化療藥物單獨使用導致細胞增殖減少更為明顯，DSTD一同作用提高了骨肉瘤細胞對阿霉素和順鉑的敏感性。

17、
　　3.Western blot結果顯示100uM的DSTD逆轉了Dox和Cis誘導的HMGB1蛋白表達水平升高。Real-time PCR結果顯示100uM的DSTD也減少了Dox和Cis誘導的HMGB1 mRNA轉錄水平升高。
　　4.Western Blot檢測結果提示:在化療時，HMGB1的過表達阻斷了DSTD誘導的信號轉導。
　　5.LDH釋放實驗結果顯示:在化療時，HMGB1的過表達阻斷了DSTD誘導的細