1、研究背景和目的 原發(fā)性支氣管肺癌(簡(jiǎn)稱肺癌)是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，是近年來發(fā)病率較高的惡性腫瘤。手術(shù)切除是治療肺癌的首選方法，但由于肺癌患者早期缺乏特異性臨床癥狀和體征，故其早期診斷率較低，確診時(shí)多數(shù)患者己處于中晚期，常失去手術(shù)機(jī)會(huì)，只能輔以放療和化療等處理。多數(shù)肺癌患者在確診后1年內(nèi)死亡，其5年生存率低于15％。化療仍是肺癌綜合治療的重要手段。目前臨床常用的幾種聯(lián)合化療方案，雖然有效率有所提高，但仍不理想，故國內(nèi)外學(xué)者均在致力

2、于尋找對(duì)肺癌更為有效的藥物。隨著研究的深入，從中草藥中提取和尋找防治腫瘤的有效成分已成為治療腫瘤的希望和新途徑。 藤梨根為獼猴桃科獼猴桃屬軟棗獼猴桃的根，具有清熱解毒、消腫疥、祛風(fēng)濕的功效。臨床上常用于抗腫瘤治療，尤其對(duì)消化道腫瘤療效較佳。近年研究發(fā)現(xiàn)，藤梨根復(fù)方制劑體外對(duì)多種腫瘤有抑制作用，可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，其藥理研究和臨床驗(yàn)證受到廣泛關(guān)注。有關(guān)藤梨根對(duì)肺癌的作用尚未見報(bào)道，本研究以人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞作為研

3、究對(duì)象，從體內(nèi)外兩條途徑觀察藤梨根提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞的生長抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用，并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行探討，以期為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：本研究分三部分 1．藤梨根提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞體外抑制作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。體外培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞；采用倒置顯微鏡觀察藤梨根提取物作用前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞繪制不同濃度藥物作用后細(xì)胞的生長曲線；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定不同濃度藥物作用不同時(shí)間對(duì)

4、A549細(xì)胞生長的抑制率；集落形成試驗(yàn)觀察不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞集落形成的影響；流式細(xì)胞術(shù)、<'3>H-TdR摻入試驗(yàn)、免疫組化法檢測(cè)不同濃度藥物作用后肺癌細(xì)胞細(xì)胞周期、細(xì)胞DNA合成、細(xì)胞核Ki-67抗原表達(dá)的變化。 2．藤梨根提取物體外誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡及作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。體外培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞；采用透射電鏡觀察藥物作用后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞的DNA ladder帶；采用流式細(xì)胞術(shù)

5、和TUNEL染色法測(cè)定不同濃度藥物作用后肺癌細(xì)胞凋亡率變化；免疫組化法和RT-PCR法檢測(cè)不同濃度藥物作不同用時(shí)間后A549細(xì)胞Bcl-2、Bax、Survivin蛋白和mRNA表達(dá)變化；采用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)不同濃度藥物作用不同時(shí)間后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。 3．藤梨根提取物在體內(nèi)抑制肺癌生長和誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。建立人肺癌裸鼠移植瘤模型，分三組(對(duì)照組、高劑量治療組、低劑量治療組)，治療組給不同劑量藤梨

6、根提取物灌胃，對(duì)照組灌服等量的溶劑。通過腫瘤體積變化，繪成移植瘤生長曲線；根據(jù)終末瘤重計(jì)算抑制率；采用透射電鏡觀察治療組移植瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；采用TuNEL染色法測(cè)定各組移植瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)；免疫組化法檢測(cè)各組移植瘤Ki一67抗原表達(dá)；通過RT-PCR和免疫組化法檢測(cè)各組移植瘤凋亡相關(guān)基因Bc1-2、Bax和Survivin的表達(dá)變化。并記錄治療組裸鼠的一般情況及血像、肝腎功變化，觀察藥物有無毒副作用。 結(jié)果1．藤梨根提取物對(duì)人

7、肺癌細(xì)胞體外抑制作用及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。 倒置顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化、臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞及MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示在體外藤梨根提取物在一定濃度下可以抑制肺癌A549細(xì)胞的生長，當(dāng)藥物濃度為10μg/m1時(shí)無明顯抑制作用，而濃度達(dá)到20μg/ml時(shí)表現(xiàn)出輕度的抑制作用，當(dāng)濃度大于40μg/ml時(shí)抑制作用明顯增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到160μg/ml時(shí)抑制作用達(dá)到高峰，細(xì)胞生長不明顯，而濃度為320μg/ml時(shí)其對(duì)生長抑制作用不再增強(qiáng)。并且在同一物濃

8、度，隨著作用時(shí)間的延長，抑制率逐漸增加，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴性。 集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)藥物濃度大于20μg/ml時(shí)對(duì)A549細(xì)胞集落形成均有抑制作用，并且隨著藥物濃度的增高，抑制作用逐漸明顯，集落形成率逐漸降低，集落抑制率逐漸增高，與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；但160μg/ml和320μg/ml兩種濃度的抑制作用無明顯差別。細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藥物作用后，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞數(shù)目增多，S期和

9、G<,2>/M期細(xì)胞數(shù)目相應(yīng)減少，細(xì)胞發(fā)生G<,0>/G<,l>期阻滯，隨藥物濃度的增加，阻滯作用增強(qiáng)，濃度為80μg/ml和160μg/ml時(shí)作用明顯。細(xì)胞在給藥72h后，其G<,0>/G<,1>期阻滯重于藥物作用48h。<'3>H-TdR摻入試驗(yàn)結(jié)果顯示給藥24h后，80、160μg/ml組cpm值下降與對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，給藥48h后40μg/ml組cpm值也低于對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.0

10、5)，而20μg/ml組則與對(duì)照組始終無差別。藤梨根提取物對(duì)A549細(xì)胞的Ki-67抗原蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長，KI逐漸降低，仍以40、80、160μg/ml組作用明顯，與對(duì)照組比較差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 2．藤梨根提取物體外誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡及作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。 藥物處理48h后各組A549細(xì)胞透射電鏡下均可見不同階段典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)為細(xì)胞體積

11、縮小，細(xì)胞漿濃縮；細(xì)胞核染色質(zhì)凝集深染，并凝聚于核膜內(nèi)側(cè)，皇新月形或指環(huán)形。細(xì)胞膜表面微絨毛和偽足減少；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，網(wǎng)腔擴(kuò)張，線粒體腫脹，內(nèi)嵴變短、消失、紊亂核糖體顆粒脫落；可見膜包裹的內(nèi)有較完整的細(xì)胞器和細(xì)胞核碎片的凋亡小體。用藥48h、72h后3種濃度藥物作用后的細(xì)胞DNA凝膠電泳均出現(xiàn)凋亡細(xì)胞所特有的特征性DNA“梯狀”條帶圖譜，對(duì)照組細(xì)胞未見凋亡和DNA“梯狀”條帶圖譜。 FCM和TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組A549

12、細(xì)胞自發(fā)性凋亡率較低，而濃度為40、80、160μg/ml的藤梨根提取物均有誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡的作用，并且隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長，其凋亡誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng)，各時(shí)段實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 免疫組化和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組A549細(xì)胞Bcl-2、Bax和Survivin蛋白和mRNA表達(dá)恒定；實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長，Bc1-2和Survivi

13、n蛋白和mRNA表達(dá)下降，而Bax蛋白和mRNA表達(dá)逐漸上升，各時(shí)段、各濃度與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 對(duì)照組A549細(xì)胞內(nèi)[Ca<'2+>]i恒定，而各實(shí)驗(yàn)組在用藥后細(xì)胞內(nèi)[Ca<'2+>]i明顯升高，藥物劑量越大，細(xì)胞內(nèi)[Ca<'2+>]i升高越明顯，12h細(xì)胞內(nèi)[Ca<'2+>]i升高最明顯，此后隨藥物作用時(shí)間延長出現(xiàn)減低，72h時(shí)[Ca<'2+>]i再次略有升高，各時(shí)段、濃度下均明顯高于對(duì)照組。3．

14、藤梨根提取物在體內(nèi)抑制肺癌生長和誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 對(duì)照組裸鼠移植瘤生長曲線符合指數(shù)生長方式，各治療組移植瘤生長緩慢，移植瘤體積明顯小于對(duì)照組，高劑量組尤其明顯，高、低劑量的藥物對(duì)肺癌裸鼠移植瘤生長抑制率分別為69.00％和45.09％。各組移植瘤體積及瘤重比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 透射電鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)治療組移植瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出不同階段的細(xì)胞凋亡表現(xiàn)：胞突減少，部分細(xì)胞完全消失，線粒體腫脹，細(xì)胞

15、核形態(tài)縮小，染色質(zhì)染色加深，向邊緣聚集，也有細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡小體。對(duì)照組、低劑量組、高劑量組的K1分別為80.36±7.35％、59.29±5.21％、23.45±6.34％；A1分別為2.00±0.82％、20.46±3.47％、43.73±5.32％；Bcl-2蛋白陽性標(biāo)記指數(shù)分別為55.86±4.49％、37.15±4．60％、23.79±4.63％；Bax蛋白陽性標(biāo)記指數(shù)分別為22.15±6.16％、42.06±6.72％、56

16、.91±3.15％；Survivin蛋白陽性標(biāo)記指數(shù)分別為44.57±3.43％、33.77±4.37％、17.46±3.8l％；各治療組與對(duì)照組之間比較及高、低劑量組之間比較，差異均有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 對(duì)照組、低劑量組、高劑量組的Bcl-2mRNA和SurvivinmRNA條帶密度遞減，bax-2mRNA條帶的密度遞增，半定量分析顯示其表達(dá)量分別為0.831±0.084、0.545±0.092、0.376±0

17、.103：0.716±0.069、0.516±0.087、0.282±0.071。O.215±0.072、0.435±0.079、0.694±0.110；上述指標(biāo)各治療組與對(duì)照組之間比較及高、低劑量組之間比較，差異均有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 各治療組裸鼠體重及一般情況與對(duì)照組相比無差異，并且未觀察到藥物相關(guān)性毒副作用，實(shí)驗(yàn)室檢查各組裸鼠血細(xì)胞數(shù)及肝、腎功能未見異常改變，治療中各組裸鼠均未見意外死亡。各組裸鼠均未見明顯

18、的轉(zhuǎn)移病灶及重要臟器病理性改變。 結(jié)論1．藤梨根提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)時(shí)效關(guān)系，在一定范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。藤梨根提取物體外抗肺癌的作用與細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞DNA合成、下調(diào)癌細(xì)胞核Ki-67抗原的表達(dá)強(qiáng)度有關(guān)。 2．在體外藤梨根提取物能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡是藤梨根提取物抗肺癌的作用機(jī)制之一；藤梨根提取物可以降低人肺癌細(xì)胞Bc-2、Survivin蛋

19、白及mRNA的表達(dá)，而提高其Bax蛋白及mRNA的表達(dá)，可升高人肺癌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i，來促進(jìn)其發(fā)生凋亡，而對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的調(diào)控，可能是藤梨根提取物體外誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 3．藤梨根提取物可明顯抑制肺癌裸鼠移植瘤的生長，降低移植瘤細(xì)胞的增殖活性，并誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡，存在量效關(guān)系。可降低癌細(xì)胞核Ki一67抗原表達(dá)，來降低其增殖活性；也可在mRNA水平和蛋白水平下調(diào)移植瘤細(xì)胞的BcL-2和Surv