1、從海洋生物中尋找高效、低毒副作用的抗腫瘤藥物是近年天然藥物研究的新領域。近年來，隨著海洋生物藥學研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)許多海洋生物尤其許多藻類，其體內(nèi)含有各種特有藥物功能。其中鈍頂螺旋藻(Spirulina ptatensis,又稱鈍頂節(jié)旋藻Arthrospira platensis)中的藻藍蛋白(C-phycocyanin，CPC)以其特有的營養(yǎng)和保健價值受到廣泛的重視。因其水溶性、無毒、清亮且著色力強等優(yōu)點，CPC被廣泛用于食品著

2、色劑和化妝品的添加劑。帶有熒光，可用作熒光標記物。另有研究表明藻藍蛋白具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗病毒、增強免疫力、清除自由基和保肝、降血脂等生理活性，這為螺旋藻在功能性食品和藥品領域的開發(fā)提供重要的決策依據(jù)。目前有關(guān)藻藍蛋白抗腫瘤免疫機理的研究國內(nèi)外報道較少，本課題研究的主要目的旨在揭示藻藍蛋白發(fā)揮作用的深層機理，以期更深層次的發(fā)揮其應用價值。 首先對鈍頂螺旋藻中藻藍蛋白的提取和純化方法進行了改進。采用磷酸鹽緩沖液循環(huán)凍融聯(lián)

3、合超生波破碎法，50％硫酸銨沉淀獲得CPC，提取率達到13.1％。粗蛋白提取液再經(jīng)過兩次羥基磷灰石柱(HA)層析和sephacrylS-200HR凝膠層析對其進行純化，純度達到4.71％。純化后的CPC在12％SDS-PAGE中得到兩條帶，分別是α和β兩個亞基，分子量分別為21.4ku和17.0ku。結(jié)果表明，通過上述分離純化過程得到了較高提取率和電泳純度的CPC。 然后我們對CPC的抗腫瘤免疫活性進行了研究。主要包括5個方面：

4、①cpc的體外抑瘤作用研究：檢測CPC對人宮頸癌細胞(HeLa)、乳腺癌細胞(MCF)、胃癌細胞(NKM)、卵巢癌細胞(SVOA)、人胚肺細胞(HEL)體外生長的影響。在體外培養(yǎng)條件下用不同濃度的CPC(終濃度為20，40，80，160μg/ml)處理這4種癌細胞和1株正常細胞，運用MTT法檢測CPC對細胞生長的影響。結(jié)果顯不CPC對這4種癌細胞均有不同程度的抑制作用，并存在濃度劑量效應，高濃度抑制作用強，但對正常細胞無明顯影響。②CP

5、C誘導HeLa細胞凋亡的分子免疫機理探討：通過流式細胞儀檢測CPC對HeLa細胞的細胞周期變化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)一個亞二倍體峰(GO-Gl)；電鏡檢測細胞的凋亡形態(tài)；瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細胞的DNA結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示DNA發(fā)生片段化，呈現(xiàn)梯狀；免疫組織化學法檢測CPC對細胞表面凋亡相關(guān)蛋白(Fas、ICAM-1、Bc1-2)表達的影響,結(jié)果表明CPC可促進促凋亡基因Fas、ICAM-1的表達同時抑制抗凋亡基因Bc1-2的表達;檢測還

6、發(fā)現(xiàn)凋亡細胞的caspase酶的活性增強且細胞內(nèi)細胞色素c由線粒體向胞漿的釋放。通過上述試驗檢測CPC對HeLa細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路的影響,從而揭示了CPC誘導HeLa細胞凋亡的作用機理。③CPC的體內(nèi)抗腫瘤免疫活性研究:建立S180荷瘤小鼠動物模型,腹腔注射CPC,11天后通過QHS、ELISA、MTT等試驗從免疫器官、免疫細胞、免疫分子水平上檢測CPC的抗腫瘤免疫效應。結(jié)果顯示,CPC組小鼠瘤塊直徑及瘤體重量均小于對照組,T細胞及B

7、細胞活性明顯增強,體液抗體量顯著提高,CPC高劑量組比低劑量組抑制腫瘤細胞生長和提高機體免疫力的作用更明顯。從而揭示藻藍蛋白的抗腫瘤作用與機體免疫系統(tǒng)免疫功能的增強有關(guān)。④探討CPC對HeLa細胞CD59基因表達的調(diào)控作用。以正常人CD59cDNA為模板,經(jīng)PCR擴增后重組入真核表達質(zhì)粒載體pALTER-MAX,然后利用陽離子脂質(zhì)體(Lipfectamine-2000)將重組質(zhì)粒和PeDNA共轉(zhuǎn)染HeLa和對照用正常中國倉鼠卵巢細胞(C

8、hinese hamster ovary,CHO)進行表達。用不同濃度的CPC作用于轉(zhuǎn)染細胞,通過核酸分子雜交技術(shù)、免疫熒光標記法和ELISA法對細胞中CD59分子的表達進行檢測。結(jié)果表明:成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pALTER-MAX-CD59,并將其導入真核細胞(HeLa,CHO),經(jīng)G418篩選獲得了CD59分子高效表達的細胞克隆。用CPC作用于篩選出的轉(zhuǎn)基因細胞,證實CPC可促進HeLa細胞表面CD59蛋白和Fas蛋白的表達、并抑制He

9、La細胞的增殖,而對于正常CHO細胞無明顯作用,從而提示CD59可能參與CPC的抑癌作用。⑤CPC介導的光動力學療法用于宮頸癌的治療:本研究是通過建立HeLa荷瘤小鼠動物模型,脾區(qū)注射藻藍蛋白后,經(jīng)He-Ne激光輻照瘤體13天后,取胸腺、脾臟檢測NK細胞活性并采用MTT法檢測免疫細胞增殖活性。取瘤塊制成石蠟包埋切片,采用免疫組織化學技術(shù)檢測組織細胞內(nèi)P53、NFκB、Fas、CD44基因的表達,以期判定藻藍蛋白是否具有光敏作用及可否作為