1、背景：肝纖維化是機(jī)體對于慢性肝損傷的一種修復(fù)性應(yīng)答。目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制主要是在肝臟多種細(xì)胞及細(xì)胞因子(CK)參與下，引起細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成與降解失衡。TGFβ是目前己知最強(qiáng)烈的纖維化促進(jìn)因子，可顯著增加ECM合成并間接抑制其降解。它必須活化后與受體結(jié)合才能發(fā)揮作用。其中Ⅰ、Ⅱ型受體在傳導(dǎo)TGFβ作用的信號通道中起主要作用，兩者缺一不可。現(xiàn)已證明，肝纖維化時，一方面由于ECM產(chǎn)生增多，另一方面是因?yàn)檎{(diào)節(jié)ECM降解的基質(zhì)金屬蛋白酶(

2、人為MMP-1，鼠為MMP-13)的活性被其主要特異性抑制劑TIMP-1所抑制，致使ECM的降解減少引起的。目前針對纖維化基因治療主要集中在單獨(dú)抑制TGFβRⅡ的表達(dá)以及單獨(dú)抑制TIMP-1的表達(dá)。針對TβRⅡ型受體及TIMP-1聯(lián)合反義治療的研究國內(nèi)外尚未見報道。本研究旨在構(gòu)建反義TβRⅡ真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，并將其與反義TIMP-1真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合導(dǎo)入大鼠肝纖維化模型中，觀察外源質(zhì)粒對實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響，這可能有助于為將來臨床慢性

3、肝病肝纖維化的治療提供新的有效途徑。方法：查閱文獻(xiàn)，采用兩對套式引物，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增TβRⅡ片段并經(jīng)測序鑒定，雙酶切純化PCR產(chǎn)物及pcDNA3.1(+)，再將TβRⅡ反向插入pcDNA3.1(+)線性質(zhì)粒，即構(gòu)建成反義TβRⅡ/pcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。將反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞JM-109，篩選陽性克隆行雙酶切鑒定及DNA測序分析。購得雌性SD大鼠90只，隨機(jī)分為：正常對照組(15只)，反義TβRⅡ+反義T

4、IMP-1質(zhì)粒組(15只)、反義TβRⅡ質(zhì)粒組(15只)、反義TIMP-1質(zhì)粒組(15只)、pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒對照組(15只)、肝纖維化對照組(15只)。實(shí)驗(yàn)中，除正常對照組外，其余以復(fù)合因素四氯化碳+飲用酒精+高脂高膽固醇飲食復(fù)制肝纖維化模型。各反義質(zhì)粒組及空質(zhì)粒對照組動物在模型制作兩周后，每隔9天經(jīng)腹腔給予脂質(zhì)體包埋好的質(zhì)粒100μg。最后一次CCl4攻擊后2天宰殺實(shí)驗(yàn)動物，取動物肝組織。采用HE染色、VG染色觀察肝組織病

5、理形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用免疫組化測定動物肝組織中Ⅰ型膠原、TβRⅡ、TIMP-1、MMP-13蛋白水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件11.0作單因素方差分析，病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果作非參數(shù)檢驗(yàn)。 結(jié)果：反義TβRⅡ/pcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；實(shí)驗(yàn)過程中空質(zhì)粒組死亡率為7％，在正常范圍；正常對照組、反義TβRⅡ+反義TIMP-1質(zhì)粒組、反義TβRⅡ質(zhì)粒組、反義TIMP-1質(zhì)粒組、pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組、肝纖維

6、化組Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)的灰階值分別為：170.450±5.694、154.410±4.877、144.984±2.629、146.008±5.630、133.470±3.932、134.547±4.750；正常對照組、反義TβRⅡ質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、肝纖維化組的TβRⅡ蛋白表達(dá)的灰階值分別為：155.677±6.010、124.442±4.088、115.190±6.839、115.064±5.720；正常對照組、反義TIMP-1質(zhì)粒組、

7、空質(zhì)粒組、肝纖維化組TIMP-1的蛋白表達(dá)的灰階值分別為：135.791±3.546、114.661±5.285、95.356±5.113、94.864±4.538，正常對照組、反義TIMP-1質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、肝纖維化組MMP-13蛋白表達(dá)的灰階值分別為：152.983±5.674、134.933±3.120、104.919±4.090、104.808±3.634；與空質(zhì)粒組、纖維化組相比，各反義質(zhì)粒組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)下降(P＜0.0

8、5)，反義TβRⅡ質(zhì)粒組TβRⅡ蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)，反義TIMP-1質(zhì)粒組TIMP-1、MMP-13蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)。正常對照組與各實(shí)驗(yàn)組之間的病理學(xué)分級有顯著性差異(P＜0.05)，反義TβRⅡ質(zhì)粒組、反義TIMP-1質(zhì)粒組病理學(xué)分級均較纖維化組、空質(zhì)粒組有明顯改善(P＜0.05)。反義TβRⅡ+反義TIMP-1質(zhì)粒組病理學(xué)分級較反義TβRⅡ質(zhì)粒組、反義TIMP-1質(zhì)粒組有明顯改善(P＜0.05)?？召|(zhì)粒組與肝纖

9、維化組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。反義TβRⅡ質(zhì)粒組與反義TIMP-1質(zhì)粒組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。 結(jié)論：1、反義TβRⅡ佃cDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2、復(fù)合因素復(fù)制大鼠肝纖維化模型成功。 3、單獨(dú)運(yùn)用反義TβRⅡ/pcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒、反義TIMP-1佃cDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒均可改善肝纖維化大鼠的病理學(xué)分級；并且減少Ⅰ型膠原蛋白的沉積。 4

10、、聯(lián)合運(yùn)用這兩種真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒能夠改善肝纖維化大鼠的病理學(xué)分級，并且減少Ⅰ型膠原蛋白的沉積，效果優(yōu)于單獨(dú)使用。 5、反義TβRⅡ/pcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒能夠減少TβRⅡ的表達(dá)，阻斷TGFβ通路。 6、反義TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒能夠減少TIMP-1、MMP-13的表達(dá)，在一定程度上恢復(fù)MMP-13的部分活性。 7、聯(lián)合運(yùn)用這兩種真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)?？梢匝泳弻?shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維