1、背景目的： 牙周病是一波及廣、危害大的口腔感染性疾病，該疾病嚴(yán)重影響人們的咀嚼消化功能，導(dǎo)致牙齒脫落，還可以成為某些全身疾病的危險(xiǎn)因素，所以牙周病一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。由于牙周病慢性、遷延的特點(diǎn)，加之耐藥性的產(chǎn)生，目前治療效果尚不理想，尋找新的藥物和新的用藥方法受到關(guān)注。前期我們針對(duì)牙周病的病因及病理特點(diǎn)，篩選以復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星合理配伍，在體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究上取得了滿意效果；并依牙周生理外形特點(diǎn)，采用新的緩釋材料，設(shè)

2、計(jì)出適用于不同牙位、不同深度、符合前后牙周袋形態(tài)的牙栓，克服了液體制劑易流失，凝膠制劑易污染，固體制劑需修剪等缺點(diǎn)。 為了進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用，本研究對(duì)該緩釋牙栓進(jìn)行了系列動(dòng)物毒理學(xué)試驗(yàn)研究；牙栓在牙周袋中抑菌消炎的同時(shí)必然也會(huì)作用于牙周組織，而人牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLF)是牙周組織的主要功能細(xì)胞，在創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生中發(fā)揮著重要作用，進(jìn)行相關(guān)分析探討緩釋牙栓對(duì)HPDLF的生物學(xué)活性的影響，為進(jìn)一步動(dòng)物、臨床試驗(yàn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

3、 方法： 1．采用冷壓法自制復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋牙栓，自然涼干，紫外照射30min，消毒備用，每枚重10mg，含原藥量1mg。 2．以1 L蒸餾水緩釋牙栓的最大濃度劑量即210 g/L，制成混懸液，按0.4ml/10g最大允許容積一次給予昆明小鼠灌胃，連續(xù)觀察14 d，觀察小鼠接受過(guò)量受試藥物所產(chǎn)生的急性中毒反應(yīng)，為多次反復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量、分析人體過(guò)量時(shí)可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。 3．將40只SD

4、雌雄大鼠，平均分到4個(gè)組中；①小劑量組：按每日5g/kg給藥；②中劑量組：按每日10g/kg給藥；③大劑量組：按每日20g/kg給藥；④空白對(duì)照組：按等容量的生理鹽水灌胃。觀察動(dòng)物反復(fù)給予受試藥物后，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及其嚴(yán)重程度，主要的毒性靶器官及其損害的可逆性，提供無(wú)毒性反應(yīng)劑量及臨床上主要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，為制定人用劑量提供參考。 4. 40只豚鼠平均分為4組進(jìn)行皮膚過(guò)敏試驗(yàn)：①空白對(duì)照組：②緩釋牙栓組(210g/L)；③輔

5、料基質(zhì)組；④陽(yáng)性對(duì)照組。試驗(yàn)前24 h在豚鼠背部?jī)蓚?cè)，剪出3cm×3cm的去毛區(qū)，觀察緩釋牙栓對(duì)皮膚的影響。 5.將20只SD大鼠下唇縫成一盲袋，然后隨機(jī)分為2組，分別用緩釋牙栓(210g/L)及等體積基質(zhì)注入袋內(nèi)，了解藥物對(duì)牙周粘膜毒性及刺激的影響。 6.選擇經(jīng)2％熒光素鈉溶液檢查證實(shí)，無(wú)角膜損傷的健康新西蘭兔6只，將緩釋牙栓(210g/L)滴入右眼結(jié)膜囊內(nèi)，觀察藥物對(duì)眼部刺激的影響。 7.利用免疫組化ABC法

6、對(duì)原代培養(yǎng)的HPDLF，進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白單克隆抗體染色，作細(xì)胞來(lái)源鑒定。 8.取生長(zhǎng)良好的第5代HPDLF，制備成濃度為4×10<'7>/L細(xì)胞懸液，每孔加入濃度分別為0、0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L經(jīng)DMEM緩釋的牙栓，單純加培養(yǎng)液作空白對(duì)照，于不同時(shí)間用酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)濃度緩釋牙栓OD值，評(píng)定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 9.取在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下培養(yǎng)24 h的96孔培養(yǎng)板HPDLF，加入濃度分別為O、0

7、.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L經(jīng)DMEM緩釋的牙栓，每孔加入1 μCi<'3>H-TdR，在液閃記數(shù)儀上測(cè)量每分鐘閃爍記數(shù)(cpm)，評(píng)定藥物對(duì)HPDLF DNA合成的影響。 10.將加有不同濃度緩釋牙栓的96孔板HPDLF，每孔加入100 μl 0.2％TritonX-100，考馬斯亮蘭染，在波長(zhǎng)570處檢測(cè)OD值，探討緩釋牙栓對(duì)HPDLF蛋白含量的影響。 結(jié)果： 1.經(jīng)一次性給予最高濃度(2

8、10g/L)，及小鼠最大灌胃容量(0.4ml/10g)緩釋牙栓后，小鼠無(wú)一中毒死亡，小鼠對(duì)緩釋劑的MTD為8.4g/kg。按公斤體重計(jì)算，相當(dāng)于50kg成人每日用量(假設(shè)32顆牙齒均用藥，每顆牙放置10mg牙栓一枚)的1300倍以上。 2.緩釋牙栓組與對(duì)照組大鼠，在60 d試驗(yàn)期內(nèi)均活動(dòng)正常、行為活潑、毛發(fā)光澤，無(wú)一死亡；體重增長(zhǎng)基本一致；血常規(guī)、肝。腎功檢驗(yàn)未見顯著性差異；5個(gè)臟器的比重量與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；經(jīng)病理切片鏡

9、下檢查，心肌纖維橫紋清晰，細(xì)胞分化好；肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞分化良好；未見腎小管變性壞死，間質(zhì)無(wú)出血或炎癥；脾無(wú)水腫；肺無(wú)充血、水腫和炎癥反應(yīng)。 3.口腔粘膜完整，緩釋牙栓組與基質(zhì)組無(wú)差異，粘膜病理切片未見改變。 4.緩釋牙栓組動(dòng)物自給藥72 h內(nèi)未出現(xiàn)紅斑及水腫，與空白對(duì)照組無(wú)差異；基質(zhì)組無(wú)致敏現(xiàn)象；陽(yáng)性對(duì)照組動(dòng)物皮膚受試區(qū)自激發(fā)給藥6 h后，有明顯輕度紅斑出現(xiàn)，無(wú)水腫，致敏率100％。 5．新西蘭兔眼部刺激試

10、驗(yàn)出現(xiàn)結(jié)膜充血，輕微水腫，少量分泌物，評(píng)分≤3分。在用藥48 h后全部消失，為可逆變化，由于大多數(shù)人認(rèn)為兔眼較人眼敏感，因此可以推測(cè)牙栓緩釋劑對(duì)人眼基本無(wú)刺激性。 6．原代HPDLF呈長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)均勻，核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，免疫組化染色表明，波形絲蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白染色陰性。 7．經(jīng)單因素方差分析的結(jié)果顯示緩釋牙栓在0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L時(shí)OD值與對(duì)照組相比沒有顯著性差異(P>0．05

11、)。 8．緩釋牙栓在0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L濃度時(shí)，與對(duì)照組比，蛋白質(zhì)OD值、DNA合成均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1．自制復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋牙栓每一批次制備規(guī)范，粒差小，體外緩釋穩(wěn)定，符合2005年版《中國(guó)藥典》對(duì)栓劑的規(guī)定。 2．急、慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明緩釋牙栓無(wú)明顯毒性作用，大鼠的一般狀態(tài)、行為活動(dòng)、飲食、尿便、體重增長(zhǎng)、血液學(xué)、血液生化學(xué)及主要臟器