1、軸突再生并與靶細(xì)胞形成功能性突觸結(jié)構(gòu)是脊髓損傷修復(fù)的主要目標(biāo)和關(guān)鍵問(wèn)題，目前大量促進(jìn)軸突再生的基礎(chǔ)研究顯示成體哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期再生失敗的主要原因是由于髓鞘抑制物的存在。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將神經(jīng)干細(xì)胞和(或)嗅鞘細(xì)胞移植到受損脊髓局部，可觀察到神經(jīng)干細(xì)胞可分化為神經(jīng)元及其它神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)突觸形成增加，并觀察到脊髓全橫斷損傷大鼠BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分改善，盡管實(shí)驗(yàn)中觀察到不少受損神經(jīng)再生或(和)出芽(待發(fā)表資料)，但受損局部

2、微環(huán)境的改變使軸突再生或出芽的距離極為有限，難以沖破髓鞘抑制因子與膠質(zhì)瘢痕形成的屏障與遠(yuǎn)側(cè)斷端形成有功能突觸。
　　 髓鞘碎片中的某些特異性成分(比如：Nogo66、髓鞘相關(guān)糖蛋白MAG、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白OMgp等)作用于軸突上的Nogo受體(NgR)及其共受體p75NTR復(fù)合物，通過(guò)小鳥(niǎo)嘌呤核苷三磷酸酶(small GTPase)Rho途徑調(diào)節(jié)軸突內(nèi)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)抑制軸突生長(zhǎng)，從而使脊髓損傷修復(fù)難以獲得滿意結(jié)果。Nogo單

3、克隆抗體IN-1可以拮抗Nogo的抑制作用，但無(wú)法與另外兩種抑制物MAG和OMgp結(jié)合。GrandPre等嘗試以競(jìng)爭(zhēng)性短肽NEPI-40來(lái)拮抗NgR的作用，結(jié)果顯示NEP1-40可對(duì)抗Nogo-66誘導(dǎo)的軸突生長(zhǎng)抑制，但對(duì)除Nogo-66外的其他髓鞘抑制物不敏感，使其在體內(nèi)應(yīng)用的效果并不十分理想，表明該短肽并不能封閉NgR所有與抑制分子結(jié)合的位點(diǎn)。因此，找到一種有效且靶向性強(qiáng)的髓鞘碎片清理方法成為當(dāng)務(wù)之急。
　　 目前，人們對(duì)巨

4、噬細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中的作用存在著兩種截然相反的觀點(diǎn)，一種認(rèn)為巨噬細(xì)胞對(duì)軸突生長(zhǎng)有抑制作用；而另一種則認(rèn)為巨噬細(xì)胞對(duì)軸突的再生起到促進(jìn)作用。在整個(gè)機(jī)體組織的修復(fù)過(guò)程中，炎性反應(yīng)貫穿始終，而炎性細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮了主要作用，它能清除壞死組織并分泌營(yíng)養(yǎng)因子，并可在機(jī)體組織修復(fù)中起著重要作用。Mantovani等認(rèn)為，巨噬細(xì)胞受炎性反應(yīng)中微環(huán)境不同信號(hào)影響，可轉(zhuǎn)變?yōu)椤斑x擇”活化型和“經(jīng)典”活化型兩種?！斑x擇”活化型巨噬細(xì)胞由IL-4

5、和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換而來(lái)，可調(diào)整免疫炎性反應(yīng)的過(guò)程，清除壞死組織的殘片，促進(jìn)血管再生、組織修復(fù)和重建；“經(jīng)典”活化型巨噬細(xì)胞可分泌前炎性細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)，對(duì)受損局部細(xì)胞造成更進(jìn)一步的損害。近年來(lái)，對(duì)于巨噬細(xì)胞在脊髓損傷致傷及修復(fù)作用報(bào)道并不多見(jiàn)。
　　 新近研究表明巨噬細(xì)胞在髓鞘碎片吞噬、促進(jìn)軸突再生及再髓鞘化過(guò)程中發(fā)揮的作用可能比我們預(yù)想的更大。
　　 1998年，Zeev-Brann報(bào)道成熟哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)

6、損傷后的自我修復(fù)中出現(xiàn)脊髓衍生炎性細(xì)胞，Buss與Schwab等研究發(fā)現(xiàn)SCI大鼠髓鞘碎片清理細(xì)胞ED-1免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，即為小膠質(zhì)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞。MASAAKI通過(guò)鼠脊髓挫傷模型(代表挫傷引起的有髓鞘碎片和髓鞘再生受抑制)與化學(xué)性脫髓鞘模型(代表早期髓鞘碎片清除和髓鞘再生的多發(fā)性硬化癥)的對(duì)比，研究了巨噬細(xì)胞聚集及其作用，作者使用綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞分別移植到經(jīng)放射線照射的脊髓挫傷模型鼠與化學(xué)性脫髓鞘模型鼠尾靜

7、脈，通過(guò)損傷脊髓免疫組化染色研究活化巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和殘留髓鞘碎片的不同水平變化，結(jié)果顯示表達(dá)綠色熒光蛋白的活化巨噬細(xì)胞構(gòu)成損傷局部主要細(xì)胞群，表明兩個(gè)模型中的巨噬細(xì)胞主要來(lái)源于骨髓，很少來(lái)源于內(nèi)在的小膠質(zhì)細(xì)胞。在免疫染色顯示在挫傷模型當(dāng)中，髓鞘碎片長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)存在，并且活化巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)在挫傷模型中比化學(xué)模型中更慢并且數(shù)目顯著減少，同時(shí)傷后2～4天RT-PCR檢測(cè)趨化因子(MCP-1、GM-CSF)低水平表達(dá)，提示活化巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的延遲與

8、挫傷性脊髓損傷后髓鞘碎片的持續(xù)存在有關(guān)，且導(dǎo)致髓鞘再生抑制。
　　 Samuel David等研究了Nogo受體(NgRs)在周圍神經(jīng)損傷中的作用。研究人員損傷鼠坐骨神經(jīng)，他們發(fā)現(xiàn)，一旦巨噬細(xì)胞到達(dá)受損部位并開(kāi)始清除工作，它們就表現(xiàn)為表面表達(dá)NgR1的活化形式，并進(jìn)入施旺細(xì)胞細(xì)胞基底部。當(dāng)恢復(fù)的神經(jīng)開(kāi)始產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)髓鞘(表達(dá)NgR配體如MAG等)，這種受體不但抑制巨噬細(xì)胞與髓鞘的結(jié)合，還會(huì)直接抑制髓鞘的形成，當(dāng)研究人員再次損傷

9、神經(jīng)，使髓鞘不能形成時(shí)，巨噬細(xì)胞繼續(xù)留在受損神經(jīng)外層施旺細(xì)胞細(xì)胞基底部吞噬髓鞘碎片。然而，NgR1基因敲除鼠坐骨神經(jīng)或使用Y-27632抑制NgR下游Rho相關(guān)激酶，可增加巨噬細(xì)胞與髓鞘的結(jié)合率，證實(shí)巨噬細(xì)胞表達(dá)的NgR參與介導(dǎo)該細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的撤離過(guò)程。有關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中巨噬細(xì)胞是否表達(dá)NgR及二者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是脊髓損傷修復(fù)中的作用有待進(jìn)一步研究。
　　 脊髓損傷后，活化的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)脊髓損傷區(qū)，髓鞘碎片的

10、清除延緩導(dǎo)致了軸突延伸的抑制，和由于星形膠質(zhì)細(xì)胞的堆積形成的瘢痕導(dǎo)致了軸突再生的抑制。我們推測(cè)，成年哺乳動(dòng)物脊髓損傷后，活化巨噬細(xì)胞迅速清除髓鞘碎片對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生與對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)的再生具有同樣重要的意義，但對(duì)于巨噬細(xì)胞在脊髓損傷中的具體作用仍需深入研究。
　　 研究目的：
　　 制備大鼠脊髓損傷模型，分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠脊髓損傷局部浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞，觀察其是否表達(dá)NgR；構(gòu)建大鼠NgR基因慢病毒載體并轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞表達(dá)

11、NgR，探討轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞的可行性；比較NgR的表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響；體外構(gòu)建神經(jīng)元損傷模型，將表達(dá)NgR的巨噬細(xì)胞、空載組巨噬細(xì)胞及不表達(dá)NgR的普通巨噬細(xì)胞與損傷的神經(jīng)元細(xì)胞共同培養(yǎng)，比較各組巨噬細(xì)胞對(duì)損傷神經(jīng)元修復(fù)、存活、分化的影響，探討表達(dá)NgRs的巨噬細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中的可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步動(dòng)物研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)和理淪依據(jù)。
　　 內(nèi)容和方法：
　　 (一)制備大鼠脊髓損傷模型，第3天及第7天時(shí)取

12、材，使用免疫熒光化學(xué)染色觀察巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及NgRs的表達(dá)情況。用酶消化法分離，獲取損傷脊髓組織局部浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞，使用雙標(biāo)免疫熒光化學(xué)染色從細(xì)胞水平觀察巨噬細(xì)胞表達(dá)NgRs情況；
　　 (二)采用RT-PCR技術(shù)獲得大鼠NgR基因編碼區(qū)片段，限制性內(nèi)切酶酶切和基因重組構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下包裝質(zhì)粒，包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝生產(chǎn)慢病毒。所獲慢病毒感染大鼠巨噬細(xì)胞后，PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞中NgR基因的插入和表達(dá)。

13、r>　　 (三)將髓鞘堿性蛋白(MBP)加入轉(zhuǎn)染NgRs的巨噬細(xì)胞、空載組巨噬細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染NgRs的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)皿中，Western blot定量檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬的MBP量，行t檢驗(yàn)(Student's t-test)，取α=0.05。
　　 (四)制備體外神經(jīng)元損傷模型，將表達(dá)NgR的巨噬細(xì)胞、空載組巨噬細(xì)胞及不表達(dá)NgR的普通巨噬細(xì)胞與損傷的神經(jīng)元細(xì)胞共同培養(yǎng)，各組分別于損傷后30min、1h、6h、12h、24h、48h

14、、72h各時(shí)間點(diǎn)提取培養(yǎng)液100μL，檢測(cè)LDH含量并采用MTT比色法測(cè)量其存活細(xì)胞的吸收值。倒置相差顯微鏡下觀察各組不同時(shí)間神經(jīng)元的形態(tài)變化，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 研究結(jié)果：
　　 (一)在假手術(shù)組中，脊髓組織中沒(méi)有浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞；免疫熒光染色顯示脊髓損傷3天后浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞表面可表達(dá)NgR，傷后7天時(shí)表達(dá)NgR的巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增多。培養(yǎng)脊髓損傷局部浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞，免疫熒光染色顯示該細(xì)胞N

15、gRs抗原染色陽(yáng)性；
　　 (二)所獲的NgR基因經(jīng)測(cè)序后與Gen Bank報(bào)道序列完全一致。重組慢病毒載體質(zhì)粒經(jīng)鑒定正確。三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞成功，收集、濃縮病毒后測(cè)定其滴度為6.7×107Tu/mL，PCR證實(shí)NgR基因插入病毒基因組。感染巨噬細(xì)胞后RT-PCR檢測(cè)試驗(yàn)組NgR-巨噬細(xì)胞組更大量表達(dá)NgR，與其余2組(Mock-巨噬細(xì)胞組、巨噬細(xì)胞組)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 (三)NgR轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞組的M

16、BP含量比非轉(zhuǎn)染組MBP含量明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，空載組與非轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯的差異(P＞0.05)；
　　 (四)表達(dá)NgR的巨噬細(xì)胞、空載組巨噬細(xì)胞及不表達(dá)NgR的普通巨噬細(xì)胞與損傷的神經(jīng)元細(xì)胞共同培養(yǎng)0.5，1，6，12小時(shí)后，各組OD值沒(méi)明顯不同。24h后，神經(jīng)損傷+NgR轉(zhuǎn)染組比其他組有明顯的差異(P＜0.05)，空載組與非轉(zhuǎn)染組沒(méi)明顯的差異(P＞0.05)，NgR轉(zhuǎn)染組與正常神經(jīng)組無(wú)明顯差別(P＞

17、0.05)。隨時(shí)間延長(zhǎng)，LDH水平在損傷神經(jīng)組中下降明顯但在NgR轉(zhuǎn)染組下降不明顯；培養(yǎng)0.5，1，6，12h后，各組OD值沒(méi)明顯差別；24h后，神經(jīng)損傷+NgR轉(zhuǎn)染組與其他組比較有明顯的差異(P＞0.05)，空載組與非轉(zhuǎn)染組沒(méi)明顯的差異(P＞0.05)，NgR轉(zhuǎn)染組與正常神經(jīng)組無(wú)明顯差別(P＞0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 成功制備脊髓損傷模型，從組織學(xué)和細(xì)胞水平證實(shí)損傷脊髓組織局部浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞表面有NgRs的