1、本研究對四種牛分枝桿菌抗原蛋白(MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6)進行了融合表達，旨在為牛結核病臨床診斷提供一種敏感、特異的診斷抗原。利用牛分枝桿菌的兩個同源蛋白質MPB70和MPB83，建立了一種雙抗原夾心膠體金免疫層析法。旨在為牛結核病的臨床診斷提供一種敏感、特異、快速、實用的新型診斷方法。主要研究內容包括： 1．牛分枝桿菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表達及相關特性分析

2、 克隆了牛分枝桿菌特異性抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的編碼基因，構建原核表達載體，誘導表達蛋白，提純融合蛋白質，并對其特性及其在牛結核病血清學診斷中的價值進行了初步評估。經(jīng)ELISA驗證該融合蛋白能分別與抗原蛋白MPB70、MPB83和CE(cfpl0-esat6)的多抗反應，說明該融合蛋白具有四個抗原蛋白的免疫學活性。Western blot分析顯示：該融合蛋白能與抗牛分枝桿菌陽性血清發(fā)生特異性反應，而與牛

3、副結核病、牛布氏桿菌病、牛巴貝斯病和牛傳染性鼻氣管炎病陽性血清不反應。熱穩(wěn)定性試驗證明該融合蛋白具有與單個蛋白相同的熱穩(wěn)定性。結果顯示，融合蛋白具有單個蛋白的免疫原性和穩(wěn)定性，作為一種新型的診斷抗原具有良好的應用前景。 2．牛結核病抗體膠體金快速檢測技術的建立 利用膠體金免疫層析技術原理，用原核誘導表達的牛分枝桿菌抗原蛋白MPB83和MPB70分別作為膠體金標記抗原和檢測線上的捕獲抗原，制備牛結核抗體檢測試紙條。結果粒徑

4、為40nm的膠體金制備的試紙條敏感性最高；膠體金最佳標記pH值為6.0；MPB83抗原最適標記量為每毫升膠體金6.5μg；MPB70抗原的最適包被濃度為3.0mg/mL；抗MPB83蛋白IgG的最佳包被濃度為2.5mg/mL；交叉試驗證明試紙條不與牛的其它非相關疾病的陽性血清反應，具有較高的特異性。比較實驗證明其敏感性顯著高于進口試紙條。 3．牛結核病抗體膠體金快速檢測技術的臨床應用 應用牛結核病抗體膠體金快速檢測方法制