1、本課題采用滅活的O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌為抗原，通過雜交瘤技術制備針對霍亂弧菌的單克隆抗體，并通過一步法配對篩選技術平臺得到2株高特異性高活性的O1群小川型霍亂弧菌單抗IXiao<,3>G<,6>和IXiao<,1>D<,9>，并以此為基礎研制成功O1群小川型霍亂的膠體金試紙條，為臨床霍亂病例診斷、高危人群監(jiān)測、流行病學調(diào)查及衛(wèi)生檢疫等提供快速、簡便、準確的檢測手段。在此基礎上以IXiao<,3>G<,6>單抗為靶標，應

2、用噬菌體隨機肽庫技術進行了霍亂弧菌模擬肽篩選，通過對篩選出的模擬肽(mimic peptide，MP)基因優(yōu)化設計，實現(xiàn)串聯(lián)重復，構(gòu)建含模擬肽與霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼基因嵌合表達的重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21中表達，鑒定其抗原性，為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的開發(fā)與設計提供實驗基礎。 第一部分霍亂弧菌單克隆抗體的制備及篩選 目的:制備并篩選出高特異性高活性的抗霍亂弧菌單克隆抗體(McAb)，為霍亂的預防診斷

3、提供有力的抗體工具。 方法:以滅活的O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術制備針對霍亂弧菌的McAb，以間接ELISA法對所需的雜交瘤細胞株進行第一輪篩選，除了用O1群小川型、稻葉型及O139群霍亂弧菌的菌體抗原進行特異性篩選外，還選用了多種包括弧菌科及其他常見細菌在內(nèi)的菌體抗原進行排除性篩選。第二輪篩選采用獨特的“單抗金標平行快速篩選技術”建立單克隆抗體細胞株配對篩選技術平臺，將純化單抗標

4、記膠體金和包被硝酸纖維素膜后兩兩組合配對篩選。 結(jié)果:用間接ELISA經(jīng)特異性初篩，共篩選出602株能分泌抗O1群小川型霍亂弧菌單抗、386株能分泌抗O1群稻葉型霍亂弧菌單抗、82株能分泌抗O139群霍亂弧菌單抗的雜交瘤細胞株。此后重復進行間接ELISA特異性篩選及交叉反應篩選，得到15株只分泌抗O1群小川型霍亂弧菌的特異性McAb、15株只分泌抗O1群稻葉型霍亂弧菌的特異性McAb、10株只分泌抗O139群霍亂弧菌的特異性Mc

5、Ab的細胞株。經(jīng)配對篩選，最后篩選出兩株只針對O1群小川型霍亂弧菌高特異性高活性的單抗：X8(IXiao<,3>G<,6>)和X2(IXiao<,1>D<,9>)。 結(jié)論:獲得兩株只針對O1群小川型霍亂弧菌高特異性高活性的McAb，為O1群小川型霍亂早期快速診斷和預防的研究提供基礎。 第二部分特異性O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體的鑒定及應用 目的:本部分我們首先對所獲得的2株只針對O1群小川型霍亂弧菌的單抗細胞株

6、IXiao<,3>G<,6>和，IXiao<,1>D<,9>進行理化性質(zhì)的鑒定和生物學特性的研究，然后用這2株單抗研制O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測卡，建立以單克隆抗體為基礎的雙抗夾心法膜式超靈敏膠體金快速檢測方法，用于霍亂的早期診斷。 方法:首先對篩選到的高特異性的兩株單抗進行了分離、純化及鑒定：先通過飽和硫酸銨鹽析的方法粗提抗體，再用Protein A親和層析法進一步純化，然后對單抗進行了包括染色體分析，亞型鑒定，效價、

7、親和常數(shù)的測定以及特異性的鑒定與分析，并通過單克隆抗體的位點相加實驗、與O1群小川型霍亂弧菌LPS的間接ELISA和westernblot實驗對兩株單抗識別的抗原表位進行了初步研究。然后采用高度特異性的抗原抗體反應及膠體金標記技術，通過雙抗體夾心法(抗體-抗原-抗體)，以2株單抗作為包被及標記抗體，制備膠體金．抗體結(jié)合物和反應膜，研制霍亂弧菌膠體金快速檢測卡，并通過特異性、靈敏度、重復性及穩(wěn)定性的檢測進行方法學評價。 結(jié)果:SD

8、S-PAGE結(jié)果表明，純化后單抗純度達95％以上，經(jīng)鑒定兩株單抗亞類分別為IgG<,2b>及IgG<,3>，特異性好、親和力高(親和常數(shù)為10<'9>)、效價高(腹水效價均達10<'-6>)，對兩株單抗識別的抗原表位進行初步研究表明兩株單抗針對的是不同抗原表位，IXiao<,3>G<,6>針對O1群小川型霍亂弧菌脂多糖，而IXiao<,1>D<,9>針對非脂多糖抗原位點。制備了O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測試紙卡，實現(xiàn)對O1群小川型

9、霍亂弧菌菌體抗原的特異檢測，建立了單克隆抗體夾心法-膠體金試紙條檢測霍亂弧菌的方法，初步試驗結(jié)果證明，該法具有很好的特異性(100％)和靈敏度(最低檢出量1×10<'4>cfu/ml)，重復性100％，穩(wěn)定性好(室溫保存一年也不失活)，檢測時間快(5分鐘可判定結(jié)果)，操作簡便等優(yōu)點。 結(jié)論:對篩選到的高特異性的兩株單抗進行分離、純化及鑒定，進一步證實這兩株單抗達到了診斷用抗體親和力的要求，對下步模擬表位的篩選及獲得能誘導保護性免

10、疫反應的模擬肽也有重要的應用價值。O1群小川型霍亂弧菌膠體金快速檢測卡能夠特異檢測O1群小川型霍亂弧菌，操作簡單，結(jié)果判定清晰可靠，解決了現(xiàn)霍亂檢測中無法對小川及稻葉型區(qū)別檢測的問題，彌補了國內(nèi)國際霍亂檢測試劑盒的一個缺口和空白點，為臨床診斷、食品安全檢測、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測、反恐和出入境檢疫等提供有效的檢測手段。 第三部分O1群小川型霍亂弧菌單克隆抗體識別表位模擬肽的篩選鑒定 目的:以純化的有高度特異性的IXiao<,3>G

11、<,6>單抗為靶分子，對噬菌體隨機7肽庫進行淘篩，以期篩選到與O1群小川型霍亂弧菌單抗有高親和力的模擬肽，為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的研制奠定基礎。 方法:運用噬菌體隨機七肽庫技術，以純化的IXiao<,,3>G<,6>單抗為靶蛋白，進行噬菌體隨機肽庫3輪篩選，以雙抗夾心ELISA和競爭抑制試驗分析獲得的噬菌體短肽與篩選配基的結(jié)合能力及特異性，并進行陽性克隆序列測定和同源性分析。 結(jié)果:三輪篩選后，陽性噬菌體得到有

12、效富集，夾心ELISA檢測隨機挑取的25個噬菌體克隆，有22個噬菌體克隆為陽性，測序表明其中20個陽性克隆的氨基酸序列完全一致，均為APAIPAS。對該序列同源性分析，未發(fā)現(xiàn)有相同的已知序列。競爭抑制試驗表明，O1群小川型霍亂弧菌LPS能很好地抑制陽性克隆與IXiao<,3>G<,6> McAb的結(jié)合，抑制程度隨LPS濃度的升高而增加，而對照細菌的LPS則不具有相應的抑制作用，進一步提示噬菌體克隆展示肽模擬了O1群小川型霍亂弧菌LPS抗

13、原表位。 結(jié)論:篩選到模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS的抗原表位的模擬肽，為基于表位的霍亂弧菌模擬多肽疫苗的開發(fā)與設計提供了實驗依據(jù)。 第四部分O1群小川型霍亂弧菌模擬肽與霍亂毒素B亞單位的重組表達及抗原性分析 目的:對篩選的模擬O1群小川型霍亂弧菌LPS抗原表位的MP基因?qū)崿F(xiàn)串聯(lián)重復，構(gòu)建含MP與霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼基因的重組質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21中表達，鑒定其抗原性，為進一步研制基于表位的霍亂弧菌

14、模擬多肽疫苗奠定基礎。 方法:用PCR方法擴增CTB目的基因片段，經(jīng)Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ雙酶切后，與進行同樣酶切處理的質(zhì)粒pET32a(+)在T4連接酶的作用下連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，通過鑒定、測序，構(gòu)建pET32a(+)-CTB重組質(zhì)粒。根據(jù)獲得的O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬表位對應的基因序列，設計寡核苷酸鏈，實現(xiàn)MP基因的串聯(lián)重復，經(jīng)PCR得到模擬肽的核苷酸鏈，克隆至重組質(zhì)粒pET32a(+)-CTB的CTB基因

15、下游，構(gòu)建含嵌合基因的重組質(zhì)粒pET32a(+)-CTB-MP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE30)，通過IPTG誘導蛋白表達，Ni-NTA．試劑盒純化目的蛋白，用間接ELISA、western-blot檢測其抗原性，用競爭抑制試驗進一步驗證MP是否模擬了O1群小川型霍亂弧菌LPS的抗原表位，還應用ELISA檢測CTB與單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM-1的結(jié)合。 結(jié)果:實現(xiàn)了串聯(lián)重復的O1群小川型霍亂弧菌LPS模擬肽(MP)與CTB的重組，

16、SDS-PAGE顯示，IPTG誘導后CTB和CTB-MP蛋白均獲得高效表達，相對分子量分別為32KD和34KD，與預期相符，目的蛋白純化后純度可達90％以上。間接ELISA、western-blot檢測表明CTB-MP融合蛋白可與IXiao<,3>G<,6>單抗結(jié)合，競爭抑制試驗表明CTB-MP可抑制IXiao<,3>G<,6>單抗與O1群小川型霍亂弧菌及O1群小川型霍亂弧菌LPS的結(jié)合，通過ELISA表明CTB與單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM