1、本試驗(yàn)以延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞保存為基礎(chǔ)，利用組織塊培養(yǎng)法，首次建立了延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞系，并對成纖維細(xì)胞進(jìn)行液氮冷凍保存，得到延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞最佳保存體系。通過從屠宰場收集卵巢，回收卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，以成熟培養(yǎng)后的去核卵母細(xì)胞作為核受體，以成纖維細(xì)胞作核供體進(jìn)行核移植，研究了延邊黃牛成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性、冷凍保存效果及克隆技術(shù)的應(yīng)用。結(jié)果表明： 1.通過組織塊培養(yǎng)法，獲得了傳代培養(yǎng)的延邊黃牛耳皮

2、膚成纖維細(xì)胞，延邊黃牛皮膚成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)呈貼壁生長，原代與早期傳代細(xì)胞是上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的混合物。 2.混合生長的傳代細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶與0.02％EDTA液于37℃下消化處理2～3min，脫壁懸浮的主要為成纖維細(xì)胞，在傳代過程中采用反復(fù)消化法將二者分離純化，獲得可正常傳代的延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞，表明采用反復(fù)消化法可以得到純化的成纖維細(xì)胞系。 3.通過繪制生長曲線研究了延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞的增殖

3、規(guī)律，用DMEM培養(yǎng)延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞，傳代后滯留期較短，約有一天左右，活細(xì)胞逐漸貼壁生長。此后進(jìn)入對數(shù)生長期，延續(xù)六天左右。第八天細(xì)胞發(fā)生接觸抑制而開始死亡，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)入平臺期，維持三天左右，細(xì)胞逐漸脫落死亡，細(xì)胞數(shù)量有所下降。 4.染色體檢測表明，延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)體系，至少可以傳至15代并保持染色體倍性正常。 5.在以延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞不同甘油濃度與不同血清濃度情況下進(jìn)行冷凍試驗(yàn)中，得

4、到最適合實(shí)驗(yàn)操作的甘油濃度為1096，血清的濃度為20％，復(fù)蘇率可達(dá)到96％。 6.在以不同密度與不同冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍試驗(yàn)中，得到適合延邊黃牛成纖維細(xì)胞冷凍保存的密度為2×10<'6>cells/mL，冷凍劑為甘油，復(fù)蘇率可達(dá)到98％。 7.冷凍保存的延邊黃牛成纖維細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，分別以20℃及37℃不同溫度解凍，結(jié)果表明：37℃條件下進(jìn)行解凍復(fù)蘇率優(yōu)于20℃(p<0.05)。 8.本實(shí)驗(yàn)采用延邊黃牛卵丘細(xì)胞、輸卵

5、管上皮細(xì)胞及耳皮肽成纖維細(xì)胞分別進(jìn)行核移植，所得結(jié)果顯示發(fā)育率差異不顯著，但三種細(xì)胞所得胚胎分裂率差異顯著(P<0.05)，其中卵丘細(xì)胞效果最好。 9.分別使用第5～7代與11～13代延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行供核操作時(shí)，5～7代所得的卵裂率比11～13代的高(P<0.05)，但發(fā)育率結(jié)果顯示11～13代比5～7代的高(P>0.05)。 10.未冷凍保存與冷凍保存的延邊黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞用做體細(xì)胞克隆供核細(xì)胞時(shí)，結(jié)果