1、目的
　　 構(gòu)建鈣網(wǎng)織蛋白基因重組腺病毒載體(Ad-CRT)及聯(lián)合紫杉醇對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231體外生長(zhǎng)增殖的影響,誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)及阻滯細(xì)胞周期的影響,判斷Ad-CRT與紫杉醇聯(lián)用對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231是否具有協(xié)同作用,并初步探討其可能機(jī)制。
　　 方法
　　 根據(jù)Genbank中提供的CRT基因序列,設(shè)計(jì)并合成引物,以人乳腺癌組織cDNA文庫(kù)為模板采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增人CRT基因片

2、段,測(cè)序后將CRT基因片段定向克隆至pShuttle-CMV重組穿梭載體,進(jìn)而將穿梭載體克隆至PacI限制性?xún)?nèi)切酶線(xiàn)性化的腺病毒載體pAdxsi;分別將不同處理因素作用于體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231,MTT法檢測(cè)各組處理因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用;PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組處理因素對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　 結(jié)果
　　 1、重組穿梭載體pShuttle-CRT經(jīng)EcoRI/KpnI酶切鑒定連接成功。酶切穿

3、梭載體將CRT片段克隆至腺病毒載體pAdxsi得到Ad-CRT,鑒定證實(shí)Ad-CRT載體構(gòu)建成功。Ad-CRT轉(zhuǎn)染293LP細(xì)胞并通過(guò)Westernblot法和Real-timePCR法證實(shí)其體外表達(dá)。
　　 2、Ad-CRT與紫杉醇對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231生長(zhǎng)抑制的影響
　　 聯(lián)合用藥組在72h之前與單純紫杉醇和單純Ad-CRT作用效果無(wú)明顯差異,但在72h后聯(lián)合用藥的效果明顯強(qiáng)于各自單純用藥組(P＜0.0

4、5)。7days時(shí)作用效果最為明顯,且隨時(shí)間的增加聯(lián)合用藥組的抑制率均比單純紫杉醇組和單純Ad-CRT組的抑制率高。
　　 3、Ad-CRT與紫杉醇對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響
　　 與空白對(duì)照組相比,各處理組抑制細(xì)胞周期的百分比均升高,聯(lián)合用藥組G2/M期為(31.1±1.24)%,S期百分比為(54.93±1.24)%,凋亡率為(26.99±1.24)%,單獨(dú)紫杉醇組G2/M期為(18

5、.64±2.04)%,S期百分比為(41.19±2.04)%,凋亡率為(12.24±2.04)%和Ad-CRT組G2/M期為(11.25±1.46)%,S期百分比為(47.06±1.46)%,凋亡率為(20.52±1.46)%。結(jié)果表明Ad-CRT聯(lián)合紫杉醇能顯著阻滯細(xì)胞周期并且促進(jìn)細(xì)胞的凋亡(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、成功構(gòu)建CRT重組腺病毒載體Ad-CRT并證實(shí)其在293LP細(xì)胞中表達(dá)。