1、研究目的：原發(fā)性肝癌是目前我國最普遍的惡性腫瘤疾病之一。由于不同的基因表型和個體差異以及廣泛的危險因素，肝癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確。肝癌因其發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，預(yù)后較差。因其對化療不敏感和對放療的耐藥性，所以肝臟切除和肝臟移植是目前唯一的根治療法，但根治性切除后患者的5年復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高，這成為肝癌臨床治療的難題。p100蛋白是一種多功能蛋白，在一些惡性腫瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)p100蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。因此我們推測p10

2、0蛋白有可能參與調(diào)控肝癌的形成。本課題旨在深入研究p100蛋白在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床特征之間的關(guān)系，期待從分子生物學(xué)水平探討p100蛋白作為肝癌檢測標(biāo)記的可行性。
　　方法：本課題分三部分進(jìn)行，通過組織水平、細(xì)胞水平和活體水平三個層次的實驗，研究p100蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用。第一部分研究p100蛋白在臨床肝癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。選取天津市第三中心醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的27例肝癌標(biāo)本作為實驗組，所有病例在術(shù)前

3、均未接受化療、放療或其他抗癌治療，并有完整的隨訪資料。另取27例相應(yīng)癌旁正常組織作為對照組。采用免疫組化EnVision法檢測肝癌組織、癌旁正常組織中p100蛋白的表達(dá)水平；分析上述指標(biāo)與肝癌腫瘤大小、病理類型、組織分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系。第二部分為構(gòu)建抑制p100蛋白表達(dá)的穩(wěn)定肝癌細(xì)胞株。首先構(gòu)建針對p100基因的小發(fā)夾RNA(shorthairpinRBA，shRNA)慢病毒表達(dá)載體，通過293T細(xì)胞包裝后產(chǎn)生的病毒感染SMMC7

4、721細(xì)胞，獲得p100穩(wěn)定沉默的細(xì)胞系。熒光顯微鏡下觀察感染效率，利用Westernblot方法檢測穩(wěn)定細(xì)胞株中p100的沉默效果。第三部分觀察慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默p100基因?qū)θ烁伟┞闶蟪闪龅挠绊?。利用前期已穩(wěn)定感染p100-shRNA慢病毒載體的人肝癌SMMC7721細(xì)胞接種于BALB/c裸鼠背側(cè)皮下，觀察裸鼠成瘤情況。以慢病毒空載體感染組作為陰性對照組。
　　結(jié)果：①免疫組化染色結(jié)果顯示：p100蛋白在肝癌組織的肝細(xì)

5、胞胞漿均有較強表達(dá)，在癌旁正常組織中亦有表達(dá)。肝癌組織中p100蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05)。肝癌組織中p100的高表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與年齡、病理類型、腫瘤大小、腹水等無關(guān)(P>0.05)。
　?、谕ㄟ^Westernblot技術(shù)鑒定，干擾p100后SMMC7721細(xì)胞株中p100蛋白表達(dá)水平明顯降低。成功構(gòu)建了具有p100干擾效果的慢病毒載體，并獲

6、得了穩(wěn)定沉默p100及對照的SMMC7721細(xì)胞株。
　?、鄢晒?gòu)建出人肝癌裸鼠移植瘤模型，p100表達(dá)下降后會抑制SMMC7721細(xì)胞的成瘤能力。
　　結(jié)論：①p100蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，并與肝癌的分化程度、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。提示p100蛋白參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。
　　②成功構(gòu)建了具有p100干擾效果的慢病毒干擾載體及p100穩(wěn)定沉默的SMMC7721細(xì)胞系。為進(jìn)一步研究p100在肝癌細(xì)胞中的