1、背景
　　 感染仍然是創(chuàng)傷病人最常見(jiàn)的并發(fā)癥,引起創(chuàng)傷感染的病原體以細(xì)菌為主。多數(shù)學(xué)者在創(chuàng)傷感染的菌群調(diào)查中發(fā)現(xiàn),革蘭氏陰性桿菌感染率高于革蘭氏陽(yáng)性球菌的感染率,并常有多種細(xì)菌的混合感染,且耐藥菌株逐年增加。早期快速診斷創(chuàng)傷感染細(xì)菌并合理應(yīng)用抗生素治療對(duì)于創(chuàng)傷感染的診治至關(guān)重要。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)鑒定法是診斷細(xì)菌感染最可靠的方法,但是耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣。因此,迫切需要建立一種快速、簡(jiǎn)易的創(chuàng)傷感染細(xì)菌診斷方法。
　　 分子生物

2、學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展使快速檢測(cè)病原微生物成為可能,其中,細(xì)菌基因診斷成為研究的熱點(diǎn)。目前,作為細(xì)菌的“活化石”,16S rDNA是常被選用細(xì)菌分類和鑒定的基因,但對(duì)于某些細(xì)菌而言種間差異較小,分辨力有限。16S-23S rDNA間區(qū)的長(zhǎng)度和堿基序列相比于16S rDNA具有更強(qiáng)的特異性,可依此對(duì)不同種的菌群進(jìn)行“指紋”識(shí)別。但是,在某一臨床樣本中同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌仍然是分子生物學(xué)技術(shù)面臨的難題之一。
　　 壓電DNA傳感器將壓電生物傳

3、感器靈敏度高與DNA雜交反應(yīng)特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)結(jié)合在一起,并可以實(shí)現(xiàn)多陣列平行分析,因此,在快速、準(zhǔn)確以及同時(shí)檢測(cè)多種臨床病原微生物方面具有廣泛的應(yīng)用前景。目前,我們已經(jīng)建立了壓電DNA傳感器檢測(cè)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)了對(duì)人乳頭瘤病毒、乙肝病毒、表皮葡萄球菌以及人巨細(xì)胞病毒等病原微生物的快速診斷。雖然如此,在這些研究中,壓電DNA傳感器還局限于對(duì)單個(gè)細(xì)菌或病毒進(jìn)行檢測(cè)。
　　 本研究構(gòu)建了一種便攜式2×5型壓電DNA傳感器陣列,實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確

4、和同時(shí)檢測(cè)5種創(chuàng)傷感染細(xì)菌。我們篩選了3種較難培養(yǎng)的病原菌,即產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌和肺炎鏈球菌,以及2種引起創(chuàng)傷感染最常見(jiàn)的病原菌,即銅綠假單胞菌與大腸埃希菌,作為研究對(duì)象。針對(duì)創(chuàng)傷感染細(xì)菌16S-23S rDNA間區(qū)自行設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增通用引物,應(yīng)用該傳感器陣列檢測(cè)PCR產(chǎn)物。檢測(cè)過(guò)程中引入了納米金顆粒質(zhì)量信號(hào)放大系統(tǒng),進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度。此外,以50例臨床樣本為檢測(cè)對(duì)象,以常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法為參照方法,對(duì)建立的壓電DNA傳感器陣

5、列檢測(cè)法進(jìn)行方法學(xué)比較和評(píng)價(jià)。
　　 方法
　　 1、利用Primer Premier5.0軟件,以細(xì)菌16S-23S rDNA間區(qū)為靶序列,在16SrDNA3'端與23S rDNA5'端保守區(qū)自行設(shè)計(jì)通用引物,篩選5種常見(jiàn)創(chuàng)傷感染細(xì)菌,提取其基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序。測(cè)序前先采用凝膠純化的方法分離片段最小的條帶,通常也是優(yōu)勢(shì)條帶,然后送上海英駿公司測(cè)序。
　　 2、將巰

6、基化的單鏈DNA探針固定于壓電DNA傳感器石英晶振金膜表面,封閉后加入合成的生物素化的互補(bǔ)靶DNA與之進(jìn)行雜交反應(yīng),最后用5 nm粒徑的鏈親和素標(biāo)記的膠體金追加標(biāo)記于雜交后的生物素化的靶DNA上,以增加石英晶振金膜表面的質(zhì)量負(fù)載,從而降低石英晶振的響應(yīng)頻率,進(jìn)一步放大頻移信號(hào)。優(yōu)化納米金顆粒溶液的使用濃度并分析該傳感器對(duì)合成靶序列的最低檢出限。
　　 3、各待測(cè)細(xì)菌DNA探針與16S-23S rDNA間區(qū)片段最小的拷貝序列互補(bǔ),

7、并遵循探針設(shè)計(jì)的一般原則擇優(yōu)選取。標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物純化后變性解成單鏈,與固定探針并封閉后的壓電DNA傳感器陣列進(jìn)行雜交反應(yīng),引入上述納米金顆粒信號(hào)放大系統(tǒng),驗(yàn)證各探針對(duì)靶細(xì)菌檢測(cè)的特異性,以銅綠假單胞為例分析該傳感器對(duì)菌懸液的最低檢出限。
　　 4、以50例臨床樣本為檢測(cè)對(duì)象,包括31例膿液和19例傷口分泌物,以常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法為參照方法,對(duì)建立的壓電DNA傳感器陣列檢測(cè)法進(jìn)行方法學(xué)比較和評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果
　　

8、 1、5種細(xì)菌基因組DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜與預(yù)期一致,且與人類基因組DNA、白假絲酵母菌、HBV DNA無(wú)交叉反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)同源性均在99.5％以上,由此可以證實(shí)該通用引物及PCR反應(yīng)體系對(duì)待測(cè)細(xì)菌PCR擴(kuò)增的有效性和準(zhǔn)確性。
　　 2、當(dāng)納米金顆粒溶液終濃度為9％(體積比)時(shí),頻移信號(hào)最大。我們將陽(yáng)性結(jié)果的閾值設(shè)為本底(空白對(duì)照)頻移平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差,即(-X)+3SD,為24.5 Hz,

9、得到最低檢出限為10-12M。另外,對(duì)不同終濃度的陽(yáng)性靶序列檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),陽(yáng)性靶序列終濃度從10-12至10-8M時(shí),頻移與其終濃度的1g值之間具有顯著的線性關(guān)系,線性回歸方程為:y=20.941gx+285.88,相關(guān)系數(shù)為0.958,P＜0.01。
　　 3、各探針檢測(cè)陰性細(xì)菌所引起的非特異性信號(hào)與檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)菌所引起的特異性信號(hào)具有顯著性差異(P＜0.05),說(shuō)明該傳感器交叉反應(yīng)弱,特異性強(qiáng)。以銅綠假單胞菌為例,最低檢出限為1

10、.5×102CFU/ml。另外,對(duì)不同濃度的銅綠假單胞菌懸液檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),菌懸液濃度從1.5×102至1.5x102CFU/ml時(shí),頻移與其濃度的1g值之間具有顯著的線性關(guān)系,線性回歸方程為:y=12.9211gx-2.597,相關(guān)系數(shù)為0.975,P＜0.01。
　　 4、參考方法檢測(cè)5種待測(cè)細(xì)菌17例陽(yáng)性樣本中,QCM法檢測(cè)有1例為陰性,其余16例與之一致;而參考方法檢測(cè)5種細(xì)菌33例陰性樣本中,QCM法檢測(cè)有3例為陽(yáng)性,其余

11、30例與之一致。我們選用McNemar檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)處理后發(fā)現(xiàn)兩種方法沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)。與作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的細(xì)菌培養(yǎng)法比較,QCM法檢測(cè)的靈敏度為94.12％,特異度為90.91％。
　　 結(jié)論
　　 1、自行設(shè)計(jì)的通用引物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種創(chuàng)傷感染細(xì)菌16S-23S rDNA間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,為細(xì)菌基因診斷提供了特異性強(qiáng)于16S rDNA的分子靶點(diǎn)。
　　 2、我們成功構(gòu)建了2×5型壓電DNA傳感器陣列,