1、上海交通大學醫(yī)學院碩士畢業(yè)論文2緒論緒論急性白血病(acuteleukemiaAL)是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病時骨髓中異常的原始細胞及幼稚細胞大量增殖并廣泛侵潤肝，脾，淋巴結等各種臟器，致使正常造血受抑，其臨床表現(xiàn)主要是以貧血、發(fā)熱、出血、肝脾及淋巴結腫大為主。AL多起病急驟，病情發(fā)展迅速，若不予以及時治療，患者通常于短時期內(nèi)即不治死亡。目前AL的治療主要還是以化療為主。眾所周知，化療所采用的通常都是一些傳統(tǒng)的細胞毒藥物，這些藥

2、物由于主要作用于DNA，RNA，微管蛋白等這些正常細胞及腫瘤細胞共有組分，致使其選擇性差，毒性強，所產(chǎn)生的嚴重不良反應常使患者難以耐受。同時反復非根治性劑量的化療，也容易誘生白血病細胞的耐藥，故其臨床療效也常常難以令人滿意。在過去的二十余年里，隨著人們對急性白血病分子生物學及遺傳學認識的不斷提高，一系列與該病發(fā)病機制密切相關的特異性分子標志被相繼發(fā)掘[12]，引發(fā)了對以這些靶點為目標的新型藥物的研發(fā)，這類藥物統(tǒng)稱為靶向藥物。相比較于傳統(tǒng)

3、化療藥，靶向藥物其優(yōu)勢在于定位準確，針對性強，在高效殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞幾乎無毒性。靶向藥物的這一高效低毒的特點也使其成為了目前研究的熱點。開發(fā)靶向藥物的前提是尋找到腫瘤細胞的分子靶點。文獻報道，一類名為PNAS2的基因具有抑制凋亡的功能[3]。在本實驗室前期的研究中我們也發(fā)現(xiàn)該基因在急性白血病細胞株及原代細胞中存在特異性的異常高表達及異常定位現(xiàn)象[47]，那么PNAS2是否可能通過抑制急性白血病細胞凋亡從而參與急性白血病的發(fā)

4、病其是否是AL治療的潛在新靶點？目前還沒有明確報道。在本研究中，我們就將圍繞上述推測展開一系列論證。在尋找AL潛在分子靶點的同時，我們又嘗試利用基因工程技術開發(fā)AL的新的靶向藥物，希望以此為臨床上AL的治療提供新的選擇。圍繞上述目的，本研究開展了以下三方面的工作：第一部分：旨在構建PNAS2小干擾RNA逆轉率病毒表達載體，在將其轉染U937細胞后，進一步獲得高效抑制PNAS2表達的U937細胞株，試圖通過這一部分的工作為下一部分研究PN

5、AS2基因與急性白血病發(fā)病的關系打下基礎。第二部分：通過觀察PNAS2表達受抑前后，U937細胞在細胞凋亡率，細胞存活率及凋亡相關因子，自噬活化因子表達水平方面的差異，對“PNAS2可能通過抑制急性白血病細胞凋亡從而參與急性白血病的發(fā)病”這一推測進行了論證。第三部分：運用基因工程技術構建了抗PNAS2單鏈抗體表達載體并將其轉上海交通大學醫(yī)學院碩士畢業(yè)論文5(8)DNA快速純化回收試劑盒北京鼎國生物公司(9)大腸桿菌菌株DH5α天根公司(

6、10)質粒DNA提取試劑盒MACHEREYNAGEL(11)轉染試劑FuGENE6RocheDiagnosticsGmbH(12)polybreneSigma公司(13)Trizolinvitrogen公司(14)DL2000DNAmakerTAKARA公司(15)抗PNAS2多克隆抗體SantaCruz1.2儀器儀器(1)微量加樣器Eppendf公司(2)細菌培養(yǎng)恒溫搖床上海比朗儀器有限公司(3)DK－S24型電熱恒溫水浴鍋上海精密實

7、驗設備有限公司(4)生物安全柜Esco公司(5)PCR基因擴增儀MJResearch公司(6)Nano2000微量紫外分光光度計ThermoFisierScientific(7)二氧化碳培養(yǎng)箱QueneSystemInc2.實驗方法2.實驗方法2.1細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)人急性單核細胞白血病細胞株U937用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，人胚腎細胞293T細胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。所有細胞系均置于37℃，含5％CO2的培養(yǎng)

8、箱中孵育。每23天傳代1次，實驗時取對數(shù)生長期細胞進行。2.2pSIRENRetroQPNAS2的構建pSIRENRetroQPNAS2的構建2.2.1RNA干擾載體信息干擾載體信息本部分所采用的RNA干擾空載體為pSIRENRetroQ載體，該載體為一經(jīng)典的逆轉錄病毒干擾載體，擁有LTR，包裝起始信號ψ等病毒包裝必須原件。在多克隆位點中，其具備BamHI和EcI酶切位點。經(jīng)上述兩酶作用后可使載體線性化，便于在其中插入所需片段。目的片段